A maturação in vitro do oócito é um dos fatores limitantes na produção in vitro de embriões. In vivo, esta maturação é um processo altamente orquestrado no qual a meiose é retomada pela onda de gonadotrofina que antecede a ovulação e que induz à queda dos níveis de AMPc no oócito. No entanto, os oócitos aspirados ao serem retirados dos folículos ovarianos retomam espontaneamente a maturação comprometendo a competência de seu desenvolvimento. O AMPc é sintetizado pela adenilato ciclase (AC) e degradado pelas fosfodiesterases (PDE), existindo algumas relacionadas à degradação do AMPc e outras do GMPc. Sendo assim, a proposição deste trabalho foi averiguar a contribuição de diferentes isoformas de fosfodiesterases na retomada da meiose e nos níveis de GMPc, AMPc e ainda, determinar quando há manutenção de AMPc em níveis elevados observando sua influência na competência oocitária e ativação da MAPK. Para isso, os complexos cumulus-oócito (CCOs) foram maturados in vitro na ausência, presença ou associação de inibidores de PDEs-AMPc e GMPc específicas e FSHr. As amostras foram avaliadas em relação a: 1) taxa de maturação; 2) níveis intracelulares de AMPc e GMPc nos CCOs; 3) taxa de desenvolvimento de blastocistos ; 4) ativação da MAPK em oócitos e células do cumulus. Os resultados obtidos no primeiro experimento indiaram que o inibidor da PDE3 foi o mais eficaz (p<0,05) em atrasar a retomada da meiose, às nove horas de maturação, porém, isolado ou em associação com o inibidor da PDE8, não foi capaz de alterar (p>0,05) os níveis de AMPc. No experimento dois, o inibidor da PDE5 isolado não influenciou a retomada da meiose (p>0,05), porém, quando associado aos inibidores da PDE3 e 8 houve atraso na retomada (p<0,05) e ainda alteraram os níveis de GMPc e AMPc (p<0,05) nas primeiras horas de maturação. O experimento três mostrou a influencia do FSHr durante a MIV, o qual estimulou a retomada da meiose, mas em associação com inibidores da PDE5 e 8 atrasa a retomada (p<0,05). Além disso, o FSHr provoca aumento do nível de AMPc e sua associação com inibidores de PDE5 e PDE8 ocasionou elevação adicional (p<0,05). As condições de cultivo estudadas no experimento quatro mostraram que a maturação induzida (pré-MIV de duas horas com agentes para elevar AMPc seguindo de 22 horas de MIV com FSH associado a inibidores de PDEs) atrasaram a retomada da meiose às nove horas de maturação, mas não afetaram progressão da meiose às 24, 28 e 30 horas. Os tratamentos, porém, não melhoraram a competência oocitária após a fertilização in vitro e ocasionaram pequenas variações na ativação da MAPK em oócitos e células do cumulus. / In vitro maturation of oocytes is a limiting factor in the in vitro production of bovine embryos. In vivo, this maturation is a highly orchestrated process in which meiosis resumption by the gonadotropin surge that precedes ovulation induces the decrease in cAMP levels in the oocyte. However, when oocytes are removed from follicles, they spontaneously resume maturation compromising the competence for its development. cAMP is synthesized by adenylyl cyclase (AC) and degraded by phosphodiesterases (PDE), and there are some PDEs related to degradation of cAMP and/or cGMP. Thus, the purpose of this work was to investigate the contribution of different isoforms of phosphodiesterases in the resumption of meiosis and levels of cAMP and, also, to determine differences in signaling pathways when maintaining high levels of cAMP and its influence on oocyte competence. For this purpose, cumulus-oocyte complexes (COC) were matured in vitro in the presence, absence or combination of inhibitors of cAMP- and cGMP-specific PDEs and FSH. Samples be were evaluated in relation to: 1) maturation rate, 2) intracellular levels of cAMP and cGMP in COCs, 3) rate of blastocyst development and 4) activation of MAPK in oocytes and cumulus cells. The results of the first experiment showed that the PDE3 inhibitor is more effective (p <0.05) in delaying meiosis resumption, at nine hours of maturation, but was not capable of altering cAMP levels (p> 0.05) either alone or in combination with the PDE8 inhibitor. In experiment two, the PDE5 inhibitor alone did not affect the meiosis resumption (p> 0.05), however, when associated with PDE3 and PDE8 inhibitors it delayed their resumption (p <0.05) and also altered cGMP and cAMP levels of (p <0.05) in the early hours of maturation. The third experiments showed the influence of FSHr during IVM, which stimulated the resumption of meiosis, but in combination with PDE5 and PDE8 inhibitors meiosis was delayed (p <0.05). Furthermore, FSHr causes increased levels of cAMP and its association with PDE5 and PDE8 inhibitors caused an additional increase (p <0.05). Culture conditions studied in experiment four showed that induced maturation (pre-IVM for two hours with agents to elevate cAMP followed by 22 hours IVM with FSH associated with PDE inhibitors) delayed the resumption of meiotic maturation at nine hours, but has no effect on meiosis progression at 24, 28 and 30 hours. The treatments, however, did not improve oocyte competence after in vitro fertilization and caused minor variations in the activation of MAPK in oocytes and cumulus cells.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-29012015-091454 |
| Date | 31 July 2014 |
| Creators | Fabiane Gilli Zaffalon |
| Contributors | Cláudia Lima Verde Leal, André Furugen Cesar de Andrade, Luciano Andrade Silva, Yeda Fumie Watanabe |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Zootecnia, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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