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Previous issue date: 2010 / Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / A vacinação com o vírus atenuado 17D/17DD é o principal método de prevenção da
Febre Amarela. Apesar do sucesso desta vacina em todo o mundo, reações adversas, aumento
da severidade dos sintomas e até casos fatais têm sido reportados, o que estimula o
desenvolvimento de uma vacina de DNA codificando seqüências específicas do vírus da
Febre Amarela (VFA). Entretanto antígenos codificados por vacinas de DNA são expressos
intracelularmente e preferencialmente apresentados ao sistema imune através de moléculas do
Complexo Maior de Histocompatibilidade de classe I (MHCI). O aumento da eficiência destas
vacinas é possível através da fusão de seus antígenos com a Proteína de Associação à
Membrana Lisossomal humana (hLAMP-1), direcionando-os para o compartimento do
Complexo Maior de Histocompatibilidade de classe II (MHCII). A via do MHCII é
responsável pela ativação de linfócitos T CD4+, importantes para sustentar a resposta celular
de linfócitos T CD8+ e para o desenvolvimento de memória, mudança de classe de anticorpos
e expansão clonal de linfócitos B antígeno-específicos. As quimeras antígeno/LAMP
apresentam uma maior indução da resposta imune quando comparadas aos antígenos nãofusionados
à LAMP. Neste trabalho, apresentamos a análise da expressão e localização
intracelular das proteínas não-estruturais NS1 e NS3 do VFA, nas suas formas fusionadas e
não-fusionadas à LAMP. Para tanto, as seqüências de DNA das proteínas NS1 e NS3 foram
selecionadas no banco de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information) e
otimizadas através do algoritmo genético do programa LETO 1.0 (Entelechon®), de acordo
com parâmetros como codon usage, estrutura secundária do mRNA, distribuição do conteúdo
GC, motivos repetitivos de DNA, sítios crípticos de splicing, dentre outros, com o intuito de
aumentar a expressão antigênica. As seqüências de DNA otimizadas foram enviadas para
síntese comercial (Geneart®) e clonadas em vetores de expressão eucarióticos, nas formas
fusionadas e não-fusionadas à LAMP. As construções vacinais obtidas foram enão utilizadas
na transfecção de células eucarióticas cujos extratos foram analisados quanto à expressão
protéica através de ensaios de Western-blot e imunofluorescência, utilizando anticorpos
policlonais específicos produzidos através da imunização de coelhos com proteínas NS1 e
NS3 recombinantes. Nestes ensaios, todas as construções vacinais apresentaram expressão
eficiente e distribuição intracelular adequada. Enquanto as proteínas nativas apresentaram a
distribuição reticular característica, os antígenos fusionados à LAMP apresentaram uma
distribuição lisossomal típica do LAMP endógeno. As respostas imunes geradas contra as
construções vacinais de NS1 foram avaliadas em camundongos BALB/c. Ambas as
construções, fusionada e não-fusionada à LAMP, foram capazes de induzir uma forte resposta
celular contra os mesmos epítopos induzidos pela vacina convencional 17DD. A resposta
gerada pela construção fusionada a LAMP, entretanto, apresentou a melhor performance. Os
resultados obtidos neste trabalho serão integrados a dados previamente obtidos em nosso
laboratório em estudos com proteínas estruturais para o desenvolvimento de vacinas de DNA
capazes de neutralizar infecções pelo VFA
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/6862 |
| Date | 31 January 2010 |
| Creators | de Lucena Palma, Mariana |
| Contributors | Helena Vega Gonzales Gil, Laura |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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