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Previous issue date: 2012-02-15 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The Ruminants Pestiviruses are often associated with temporary and subclinical or mild clinical signs, with the largest losses related to the infection of pregnant females that can cause fetal loss and birth of persistently infected (PI) animals. The Pestivirus are distributed in many countries, including Brazil, where studies in goats and sheep are scarce. Several studies have reported the use of molecular techniques for detection of Pestivirus, among them, the RT-PCR and the RT-qPCR.They are able to detect PI animals, which are the main source of the virus-Care in the herd. The objective of this study was to determined the lower limit of detection for Pestivirus from supernatant cell culture and serum samples from small ruminants using RT-PCR and qRT-PCR. The extraction of nucleic acids was performed with a commercial kit QIAamp ® MinElute ® Virus Spin, the reverse transcriptase reaction followed the protocol recommended by the manufacturer of the enzyme reverse transcriptase M-MLV. The evaluation of the detection limit of RT-qPCR and RT-PCR was performed using a Pestivirus calibration curve (dilution factor 10) with known and decreasing TCID50/mL called panpestivirus using primers (Vilcek et al., 1994).The detection limit of RT-qPCR in cell culture supernatant was 10-3 TCID50/mL and of RT-PCR was 10.2 TCID50/mL, since the lower limit of detection using sera weeding, sheep and Gibco ® Lamb as a diluent were TCID50/mL. The tests conducted under the conditions described in this study proved to be sensitive and can be used as a strategy for etiologic diagnosis of Pestivirus, especially for the molecular identification of IP animals, which is essential for the control of Pestiviroses. / Em ruminantes as pestiviroses são frequentemente associadas a infecções subclínicas ou com sinais clínicos leves e passageiros, sendo as maiores perdas relacionadas com a infecção de fêmeas prenhes que podem causar perdas fetais e nascimento de animais persistentemente infectados (PI). Os Pestivirus estão distribuídos em muitos países, inclusive no Brasil, onde estudos em caprinos e ovinos são escassos. Vários estudos têm relatado a utilização de técnicas moleculares para a detecção de Pestivirus, dentre elas a RT-PCR e a RT-qPCR que são capazes de detectar animais PI, principal fonte de manutenção do vírus no rebanho. Objetivou-se com este estudo determinar o limite mínimo de detecção para Pestivirus a partir de sobrenadante de cultura celular e soro de pequenos ruminantes utilizando a RT-PCR e qRT-PCR. A extração dos ácidos nucléicos foi realizada com kit comercial QIAamp® MinElute® Virus Spin, a reação de transcriptase reversa seguiu o protocolo recomendado pelo fabricante da enzima transcriptase reversa M-MLV. A avaliação do limite de detecção da RT-qPCR e RT-PCR para Pestivirus foi realizada utilizando uma curva de calibração (fator de diluição 10) com TCID50/mL conhecidas e decrescentes utilizando primers denominados panpestivírus. O limite de detecção da RT-qPCR em sobrenadante de cultura celular foi de 10-3 TCID50/mL e da RT-PCR foi de 10-2 TCID50/mL, já o limite mínimo de detecção utilizando os soros capino, ovino e Gibco® Lamb como diluentes foram de 1 TCID50/mL. Os ensaios realizados nas condições descritas nesse estudo demonstraram ser sensíveis, podendo ser utilizados como uma estratégia de diagnóstico etiológico do Pestivirus, sobretudo para a identificação molecular de animas PI, o que é essencial para o controle das pestiviroses.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede2:tede2/5327 |
| Date | 15 February 2012 |
| Creators | CAMPINHO, Daniela da Silva Pereira |
| Contributors | CASTRO, Roberto Soares de, MAIA, Rita de Cassia Carvalho, GOMES, Ana Lisa, LEITE, Adriana Soares |
| Publisher | Universidade Federal Rural de Pernambuco, Programa de Pós-Graduação em Ciência Veterinária, UFRPE, Brasil, Departamento de Medicina Veterinária |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRPE, instname:Universidade Federal Rural de Pernambuco, instacron:UFRPE |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | -3061482854177903105, 600, 600, 600, 600, -3020210563763616780, 453670264235017319, -2555911436985713659 |
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