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Previous issue date: 2007-08-16 / Universidade Federal de Sao Carlos / Penicillin G acylase (PGA) is an important enzyme for industry, used to produce
aminopenicillanic acid, a key intermediate in the synthesis of ampicillin, among other betalatam
antibiotics. The production of this enzyme by Bacillus megaterium has been studied by
the research group for several years. This work advances this research, aiming not only at the
enhancement of the enzyme production, but also at a better understanding of B. megaterium
regulatory expression mechanisms for PGA. A systematic study of the inoculum, including
conservation strategies for the microorganism, was performed. Different cultivation media
and operational conditions for the production of PGA were investigated, especially
temperature and dissolved oxygen concentration. Enzyme recovery was also studied,
including methodologies for minimizing protein contents in whey. Cheese whey is an
important nutrient for enzyme production, but its use implies the presence of contaminant
proteins in the culture broth. Finally, the enzyme was kinetically characterized.
During the inoculum study, PGA yields of microorganisms conserved using different
techniques were compared: endospores in 20%-glycerol, -50oC (cryotubes), endospores in
solid medium, in refrigerator ( slants ) and vegetative cells in 5%-glycerol, -50oC
( eppendorffs ). It was observed that cryotubes (frozen spores) preserve the enzyme
production levels for 12 months, 521 IU/L ±20 IU/L with great reproducibility. Conservation
in slants shows a marked fall of production after one month, with a low reproducibility
along months. Freezing vegetative cells leads to the highest patterns of enzyme production, up
to 900 IU/L, but preservation is sustained for only five months. Maximum specific growth
rates changed according to the conservation method, with µmax eppendofor > cryotube >
slant . A study of the effect of the inoculum growth period on enzyme yield has shown that,
for the three conservation methods, harvesting between 8 and 12 h leaded to similar cell mass
and enzyme concentrations after 24 h of cultivation. The procedure of harvesting the
inoculum after 12 h, with 10%-bioreactor inoculum volume, showed to be a good method for
inoculum standardization. The effect of temperature on the cultivation of B. megaterium for production of PGA was
assessed in the range 24-40oC. Maximum cell concentration and maximum enzyme yield were
achieved at 30oC.
The effect of the concentration of dissolved oxygen on the production of PGA was studied,
using air to feed the bioreactor (culture medium volume: 1.2-2.0 L). A second B. megaterium
strain showed a lower growth rate than the original one, demanding 24 h for
germination/propagation, while the original one requires 12 h. Thus, different oxygen (air)
feeding strategies were tested for both strains. Along the years, enzyme yields in agitated
flasks have been higher than in bioreactor, for almost all assays. For the second strain,
sustaining the dissolved oxygen at 10% of saturation leaded to the highest enzyme
productivity among all tested conditions, with a bioreactor productivity similar to the agitated
flasks. For the original strain a similar production was only achieved with an increasing
stirring profile, implying a very low dissolved oxygen concentration, equal to zero during
long periods of the cultivation. The two strains presented different dissolved oxygen
requirements. Changes in the cultivation medium also implied different dissolved oxygen
requirements for a maximum enzyme yield.
Cheese whey has a still no-identified substance that is an essential nutrient for enzyme
production. The use of enzymatically hydrolyzed cheese whey improves the downstream
process. Assays in agitated flasks, with the original strain, using hydrolyzed whey, leaded to
PGA levels similar to the ones obtained using integral whey. However, in bioreactor the yield
of enzyme was always lower than in agitated flasks, no matter the aeration strategy that was
used. Three possible explanations for this fact were investigated: 1) microorganism
preservation method; 2) changes in the time necessary for attaining and sustaining the
metabolic state where enzyme expression occurs, what could be related to the ratio between
vegetative cells and spores along time, in flasks and in the bioreactor; 3) increase in the
production of proteases in the bioreactor, compared to the flasks. The lower yield using
hydrolyzed whey does not seem to be related to none of these hypotheses, and up to now it
was not possible to generalize the study of the effect of this variable on the PGA production
by B. megaterium.
Enzyme purification and concentration, via ultra-diafiltration, in the presence of integral and
hydrolyzed whey was another subject for research. The effect of pH and of the number of
washing cycles on enzyme recovery was assessed. Results showed that this technique is
efficient, provided it is run at low temperatures. Hydrolyzed whey indeed eases the
purification of the enzyme using membranes, and great part of the contaminant whey proteins can be removed. However, an expressive loss of PGA occurs during the diafiltration stages,
which must be minimized. pH did not influence enzyme recovery.
The kinetic characterization of the produced enzyme, using the hydrolysis of penicillin G as
standard reaction, has showed that maximum PGA activity is at pH 8 and 37oC. Estimated
Michelis-Menten parameters were Vmax= 0.0344 mMPenG/min and Km=1.83 mM, with
activation energy equal to 27.12 KJ/mol. / Penicilina G acilase (PGA) é uma importante enzima industrial usada para produção do ácido
6-aminopenicilânico, intermediário chave na produção de ampicilina e outros antibióticos β-
lactâmicos semi-sintéticos. A produção dessa enzima por Bacillus megaterium vem sendo
estudada no grupo há muitos anos. Esta tese dá continuidade a esse estudo visando não só
aumento da produção da enzima, mas também um melhor entendimento dos mecanismos
regulatórios da expressão de PGA por B. megaterium. Neste trabalho foi realizado um estudo
sistemático do inóculo, incluindo estratégias para conservação do microrganismo. Foram
investigados diferentes meios de cultura e condições operacionais de cultivo na produção de
PGA, em especial temperatura e concentração de oxigênio dissolvido. A recuperação da
enzima foi também estudada, incluindo metodologias para minimização do conteúdo de
proteínas presentes no soro de queijo, um nutriente importante na produção da enzima, mas
cujo uso implica também a presença de proteínas contaminantes no meio de cultivo.
Finalmente, a enzima foi caracterizada cineticamente.
No estudo do inóculo foram comparados, ao longo do tempo, os desempenhos na produção de
PGA de microrganismos conservados como endósporos em glicerol 20% v/v, a -70°C
(criotubos), como endósporos conservados em meio sólido a 4ºC ( slants ) e como células
vegetativas em glicerol 8% v/v, a -70°C ( eppendorfs ). Verificou-se que sob a forma de
esporos congelados (criotubos) há preservação dos níveis de produção da enzima até 12
meses, 521 UI/L ± 20 UI/L, com grande reprodutibilidade. Conservação como slants além
de mostrar variabilidade ao longo dos meses, apresenta queda acentuada desde o primeiro mês
de conservação. Congelamento de células vegetativas conduz a níveis mais altos de produção
da enzima, 900 UI/L, mas preserva atividade apenas durante cinco meses. Velocidades
específicas máximas de crescimento dos microrganismos variaram com a forma de
conservação, com µmáx eppendorf > criotubo > slant . Estudo do efeito do tempo de
crescimento do inóculo na produção da enzima mostrou que, para as três formas de
conservação estudada, a colheita do microrganismo entre 8 e 12 horas de cultivo conduzia a
produções de enzima e concentração do microrganismo similares após 24 horas de produção. O procedimento de colheita após 12 horas de cultivo, com inoculação de 10% do volume de
biorreator, mostrou-se, assim, um bom critério para padronização do inóculo.
Foi estudada a influência da temperatura no cultivo de B. megaterium para produção de PGA
na faixa entre 25-40°C. Os resultados mostraram que a máxima concentração celular e a
máxima produção da enzima ocorrem no cultivo a 30°C.
O efeito da concentração de oxigênio dissolvido na produção de PGA foi extensamente
estudado, sendo o biorreator (volume de meio: 1,2-2,0 L) alimentado com ar. Uma segunda
linhagem de B. megaterium mostrou crescimento mais lento que a original, requerendo 24
horas para a fase de germinação/propagação, enquanto que a original requer 12 horas. Foi,
assim, efetuado estudo em biorreator com diferentes estratégias de fornecimento de oxigênio
(ar) para as duas linhagens. Ao longo dos anos, a produção de enzima em frascos agitados
vem se mostrando maior que a obtida em biorreator em quase todos os ensaios realizados. A
segunda linhagem mostrou de forma clara que a manutenção da concentração de oxigênio
dissolvido em 10% da saturação conduzia à maior produção da enzima dentre todas as
condições testadas, com produção em biorreator similar à obtida em frasco agitado, 450 UI/L.
Entretanto, produção em biorreator similar à obtida em frasco agitado, 550-600UI/L, só foi
obtida com a linhagem original usando-se um perfil crescente de agitação, que implicava
concentração de oxigênio dissolvido muito baixa, permanecendo em zero por vários períodos
ao longo do cultivo. As duas linhagens apresentaram, portanto, requerimentos diferenciados
para o oxigênio dissolvido. Alterações no meio de cultivo também alteram o requerimento de
oxigênio dissolvido para obtenção da máxima produção da enzima.
Soro de queijo possui um fator que ainda não foi possível identificar que é nutriente essencial
para a produção da enzima. O uso de soro hidrolisado permite melhor recuperação da enzima.
Ensaios em frascos agitados, com a linhagem original, na presença de soro hidrolisado,
conduziram a níveis de PGA similares aos obtidos com soro integral. Contudo, em biorreator,
para todas as condições de oxigênio dissolvido testadas a produção da enzima era inferior à
obtida em frascos agitados, qualquer que fosse a estratégia de aeração usada. Foram
investigadas três possíveis explicações para esse fato: 1) forma de preservação do
microrganismo; 2) alteração no tempo para se atingir e/ou manter o estágio metabólico onde
ocorre expressão da enzima, o que poderia estar relacionado com a proporção entre células
vegetativas/esporos ao longo do tempo em frascos agitados e biorreator; 3) aumento na
produção de proteases no ensaio em biorreator em relação ao ensaio em frasco agitado. A
menor produção com soro hidrolisado não parece estar relacionada com nenhuma dessas hipóteses, não tendo sido possível, portanto, até o momento, generalizar o estudo do efeito
dessa variável na produção de PGA por B. megaterium.
Foi efetuado estudo da concentração e purificação da enzima produzida na presença de soro
integral e hidrolisado, através de ultra-diafiltração. Foi estudado o efeito do pH e do número
de lavagens na recuperação da enzima. Resultados obtidos mostraram eficiência da técnica
para concentração da enzima, se realizada a baixa temperatura. Mostraram também que soro
hidrolisado realmente facilita a purificação da enzima através da filtração em membrana,
permitindo remoção de grande parte das proteínas contaminantes introduzidas no meio com o
soro de queijo. Contudo, ocorre expressiva perda de PGA durante as etapas de diafiltração,
que devem ser minimizadas. O pH não influenciou na recuperação da enzima.
Caracterização cinética da enzima produzida para a hidrólise de penicilina G mostrou que a
máxima atividade de PGA ocorre a pH 8 e temperatura de 37°C. Os valores estimados para os
parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten foram de Vmáx e Km de 0,0344 mMPenG/min e 1,83
mM, respectivamente, com energia de ativação de 27,12 KJ/mol.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/3854 |
| Date | 16 August 2007 |
| Creators | Souza, Vanessa Ribeiro de |
| Contributors | Giordano, Raquel de Lima Camargo |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Engenharia Química, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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