O Brasil é o maior produtor de laranja doce do mundo, mas a história da citricultura brasileira é marcada por sucessivas perdas devido a pragas e doenças que atacam os pomares. Entre as doenças que afetam os pomares de citros, o huanglongbing (HLB) tem merecido destaque nos últimos anos. O HLB já é conhecido desde 1900 na China, mas no Brasil essa doença está presente desde 2004 e tem causado perdas significativas a citricultura. Essa doença é associada a três espécies de \"Candidatus Liberibacter\", mas no Brasil a espécie Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) é a mais comum. Devido à ausência de plantas de laranja doce resistentes a essa doença, a busca por plantas transgênicas que apresentem resistência a essa doença têm se intensificado nos últimos anos. Uma estratégia para projetar uma construção gênica visando a CLas é a utilização de promotores floema-específico, pois a CLas coloniza o floema das plantas de citros infectadas. Entretanto, para provar que uma sequência promotora funciona é preciso desafiar a construção gênica na presnça da CLas. Portanto, conduziu-se este trabalho com o objetivo de multiplicar plantas de Citrus sinensis Osbeck (L.) cv. \'Hamlin\' transgênicas contendo o gene uidA sob controle dos promotores floema-específicos Arabidopsis thaliana phloem protein 2 (AtPP2), Citrus phloem protein 2 (CsPP2) e Arabidopsis thaliana sucrose transporter 2 (AtSUC2), inocular com CLas por Diaphorina citri, avaliar a interdependência entre a expressão do transgene (gene uidA) e a concentração de CLas, para poder inferir sobre o controle da expressão dos promotores quando as plantas são inculadas com CLas. Para isso, cinco eventos de transformação de cada construção gênica, contendo apenas uma cópia do transgene foram selecionados, multiplicados e inoculados com CLas por Diaphorina citri, dezoito meses após a inoculação, o DNA e o RNA das plantas foram coletados. Foi realizada análise para verificar a concentração de CLas em todas as plantas inoculadas e a expressão do gene uidA foi realizada em uma linhagem transgênica de cada construção gênica. Com o auxílio da análise de coeficiente de correlação de Person, foi possível classificar qualitativamente a interdependência entre a concentração bacteriana e a expressão gênica. A frequência média de inoculação de CLas por Diaphorina citri foi de 30 %, demostrando que é possível incular CLas via Diaphorina citri. A análise de coeficiente de correlação de Person mostrou que nas construções com promotores AtPP2 e CsPP2 há baixa interdependência entre o controle da expressão gênica e a concentração de CLas. A construção sob controle do promotor AtSUC2 apresentou correlação forte e positiva, mostrando que quanto maior a concentração de CLas maior a expressão do transgene. / Brazil is the largest producer of sweet oranges in the world, however the Brazilian citrus history is marked by successive losses due to pests and diseases attacking orchards. Among the diseases affecting citrus groves, the huanglongbing (HLB) has been highlighted in recent years. The HLB is known in China since 1900, although in Brazil this disease has been present since 2004 and has caused significant losses to citrus industry. This disease is associated with three species of \"Candidatus Liberibacter\", however, in Brazil Candidatus Liberibacter asiaticus species (CLas) is the most common. Due to the absence of sweet orange plants resistant to this disease, the search for transgenic plants with resistance to this disease have intensified in recent years. One strategy to design a genetic construct targeting the CLas includes the use of phloem-specific promoters, because the CLas colonizes the phloem of infected citrus plants. On the other hand, to prove that a promoter sequence works it is necessary to challenge the genetic construct in the presence of CLas. Therefore, we conducted this study with the objectives of multiplying transgenic Citrus sinensis Osbeck (L.) cv. \'Hamlin\' bearing the uidA gene under the control of the phloem-specific promoters Arabidopsis thaliana phloem protein 2 (AtPP2), Citrus phloem protein 2 (CsPP2) and Arabidopsis thaliana sucrose transporter 2 (AtSUC2), inoculate CLas with Diaphorina citri, and evaluate the interdependence between the expression of the transgene (uidA gene) and the concentration of CLas, to infer the promoter expression when the plants are inoculated with CLas. Five events processing of each gene construct, containing only one copy of the transgene, and inoculated with CLas by Diaphorina citri. The DNA and RNA of plants were collected after eighteen months of inoculation. The concentration of CLas in the inoculated plants and the expression of the uidA gene were performed in each transgenic line of each gene construct, with the aid of the analysis of Person correlation coefficient. Thus it was possible to classify qualitatively the interdependence between bacterial concentration and gene expression. The average frequency of CLas inoculation by Diaphorina citri was 30%, demonstrating that it was possible to inoculate CLas via Diaphorina citri. Person correlation coefficient values suggested low interdependence between the control of gene expression and the concentration of CLas in constructions with promoters AtPP2 and CsPP2. The construction under AtSUC2 promoter control showed strong positive correlation, indicating that the higher the concentration of CLas the greater is the transgene expression.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-08072014-083847 |
| Date | 15 May 2014 |
| Creators | Miyata, Luzia Yuriko |
| Contributors | Mourão Filho, Francisco de Assis Alves |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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