Transposons sind genetische Elemente, die fähig sind, sich innerhalb des Genoms zu bewegen. Sleeping Beauty (SB) gehört zur Tc1/mariner-Superfamilie von Transposons. SB wurde aus molekularen Fossilien rekonstruiert um u.a. einen sicheren und effizienten Vektor für die Gentherapie zu schaffen. Zu diesem Zweck ist es notwendig, den Mechanismus der SB-Transposition und deren Regulation, die Aktivitäten des Proteins und den Einfluss von Wirtsfaktoren genau zu verstehen. In meiner Arbeit habe ich die einzelnen Schritte des Transpositionsprozesses und die Bildung des sogenannten paired-end complex (PEC) – eine Voraussetzung für die folgenden katalytischen Reaktionen – untersucht. Zusätzlich habe ich versucht, einen in vitro Transpositionstest für SB zu etablieren. SB gehört zur IR/DR-Gruppe der Tc1/mariner-Superfamilie. Im Gegensatz zu mariner-like-Elementen ist die IR/DR-Struktur von SB durch lange IRs mit insgesamt vier Bindestellen für die Transposase gekennzeichnet. Ich habe die Fähigkeit dieser beiden Transposon-Systeme zum Ausschneiden eines Transposonendes ohne die Beteiligung des anderen Endes im PEC getestet. Solche unpräzise Transposition kann zu genomic rearrangements führen. Meine Ergebnisse zeigen, dass SB zwar imstande ist, ein einzelnes Transposonende auszuschneiden, dies geschieht jedoch weit weniger effizient als bei mariner-like-Elementen. Die Unterdrückung unpräziser Transpositionsereignisse ist ein Ergebnis der besseren durch die IR/DR-Struktur bedingten Regulation von SBs Transposition. Die Komplexität der IRs in Kombination mit der zweiteiligen DNA-Bindedomäne von SB kann als Mittel einer raffinierten Regulation des Transpositionsprozesses angesehen werden, welche das Genom vor anormalen Transpositionsereignissen schützt. Die Ergebnisse meiner Arbeit legen ein Modell nahe, in dem die Bildung des PEC während der Transposition von SB ein höchst genau regulierter Prozess ist, der durch die DNA-Protein- und Protein-Protein-Bindeaffinitäten geleitet wird. / Transposons are pieces of DNA able to move within the genomes. Sleeping Beauty is a verterbrate Tc1/mariner transposon reconstructed from molecular fossils to create a safe and efficient vector for gene therapy. For that purpose it is important to deeply understand the mechanism and regulation of the SB transposition, the activities of the transposase and influence of host factors on the process. Therefore, in this project I studied the single steps of the transposition reaction and formation of the paired-end complex (PEC) which is a prerequisite for the subsequent catalytic steps. Additionally, I tried to establish an in vitro transposition assay for Sleeping Beauty that would serve an easy assay for testing the system and probe mechanisms affecting the regulation of transposition activity. Sleeping Beauty belongs to the IR/DR subfamily of the Tc1/mariner-like transposons. In contrast to mariner-like elements the IR/DR structure of SB is characterized by long IRs with four binding sites for the transposase. I compared the ability of the two systems to perform cleavage of the single transposon end without including the second end in the PEC. Such imprecise transposition can lead to genome rearrangements. My results show that SB is capable of single-end cleavage; however, to much lower extent than the mariner-like element. Lower number of imprecise transposition events is a result of better regulation of the SB transposition imposed by the IR/DR stucture. The complexity of the inverted repeats together with the bipartite DNA-binding domain of SB might offer means for more sophisticated regulation of the transposition process, thereby protecting the genome from aberrant transposition events. I propose that complex formation in SB transposition is a strictly regulated ordered assembly process, guided by DNA-protein and protein-protein interaction interfaces of the DNA-binding subdomains. Obtained results allowed me to draw a model how the paired-end complex is formed.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/16869 |
| Date | 13 October 2010 |
| Creators | Pryputniewicz-Drobińska, Diana |
| Contributors | Börner, Thomas, Leutz, Achim, Schumann, Gerald |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
Page generated in 0.0027 seconds