Einleitung: Fibroblasten bilden essentielle Komponenten des Bindegewebes und reagieren auf Bestrahlung mit langwelligem Licht. In der Zellkultur lässt sich durch Lichtsignale eine gerichtete Migration (= Phototaxis) induzieren. Da die Migration von Fibroblasten eine zentrale Rolle für die Wundheilung und Regeneration des Bindegewebes spielt, hat die Phototherapie mit langwelligem, nicht-thermischem Licht besondere klinische Bedeutung erlangt. Eindeutige Vorgaben für phototherapeutische Anwendungsparameter existieren bisher jedoch nicht.
Fragestellung: Frühere Versuchsanordnungen zur vitalmikroskopischen Untersuchung der Phototaxis von 3T3-Fibroblasten arbeiteten in geschlossenen Kulturflaschen mit Latex- Kügelchen als Lichtquellen, die von externen Strahlungsquellen aktiviert wurden. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung einer faseroptischen Anordnung mit freier Positionierbarkeit in der offenen Kulturschale. Die primäre Fragestellung war die Eignung der Methode zur Erstellung eines Aktionsspektrums für Phototaxis photoresponsiver, adhärent wachsender Zellen.
Material und Methoden: Die Versuche wurden mit NIH-3T3-Zellen der Schweizer Maus durchgeführt. Um die Ergebnisse nicht durch Fremd-Chromophore zu verfälschen, wurden native Zellen ohne Färbemethoden vitalmikroskopisch untersucht. Eine speziell entwickelte Faseroptik und LED-Lichtquellen mit verschiedenen Wellenlängen ermöglichten die direkte Einbringung und Positionierung der Lichtsignale auf dem Boden der Kulturschale. Ein wissenschaftliches Bildbearbeitungsprogramm wurde durch ein Plug-In so modifiziert, dass die Bewegungs- und Zeitparameter halbautomatisch erfasst werden konnten.
Ergebnisse: Bei 18 von 44 Langzeitversuchen konnte eindeutiges phototaktisches Verhalten mit Zellkontakt zur Lichtquelle induziert werden. In 16 Fällen kam es zur migratorischen Annäherung und in 10 Fällen zu keiner Reaktion bzw. einer diskret negativen Phototaxis. Das positive phototaktische Verhalten der beiden reagierenden Gruppen war hochsignifikant, der zweiseitige p-Wert des Binomialtests beträgt 0,000388. Bei 77,3 % der Versuche konnte positive Phototaxis demonstriert werden.
Schlussfolgerungen: Das neu entwickelte Verfahren eignet sich zur Untersuchung einer Phototaxis und kann damit prinzipiell zur Erstellung von phototaktischen Aktionsspektren eingesetzt werden. Im Vergleich zu bisherigen Methoden können die Bestrahlungsstärken direkt am Lichtwellenleiter gemessen und unerwünschte Fremdkörper-induzierte Wechselwirkungen eliminiert werden. Durch die freie Positionierbarkeit der Lichtquelle in der Kulturschale können die zu beobachtenden Zellen beliebig ausgewählt werden. / Background: Fibroblasts are essential constituents of connective tissue and react upon irradiation with long-wavelength light. In cell culture, directed migration (= phototaxis) can be induced by light stimuli. Fibroblast migration and activity play a central role for wound healing and connective tissue regeneration. In consequence, phototherapy with non-thermal, long wavelength light obtained increasing clinical importance. However, accepted guidelines for phototherapeutical treatment parameters are still lacking.
Objective: Existing assays for microscopic observation of phototactic reaction of 3T3- fibroblasts in a live cell chamber use closed cell culture flasks with small light-scattering latex particles attached to the surface of the flask bottom prior to cell seeding, which can be illuminated by an external light source. The present work describes the development of a fiberoptic assembly providing free positioning of the light source in an open culture dish. The primary objective is the eligibility of this method for determination of a phototactic action spectrum for photoresponsive adherent cell species.
Materials and Methods: Experiments were conducted using Swiss mouse NIH-3T3-cells. Native cells without staining were used for elimination of potential dye-induced cell-light interferences. A light microscope with field illumination shutter simulation and live cell chamber was used in combination with a specially devised LED-light-fed fiberoptic assembly providing different wavelengths, which could be directly positioned on the inner bottom of the culture dish. A scientific image processing application was modified by a special plug-in for semi-automatic acquisition of cellular locomotion parameters and temporal data token.
Results: A total of 44 experiments were conducted. 18 essays resulted in full phototactic reaction characterized by pseudopodium contact with the fiberoptic aperture, another 16 essays showed migratory approximation without direct contact with the light source. 10 essays displayed no reaction or discrete negative phototaxis. The positive phototaxis of the two responding groups was highly significant in the two-sided binomial test (p = 0.000388). For 77.3 % of the experiments positive phototaxis could be demonstrated.
Conclusions: The newly developed assay is appropriate for the induction of phototactic behaviour and can be utilized for the determination of phototactic action spectra. In contrast to existing methods the irradiances can be measured directly at the aperture of the optical fiber and biasing foreign object-induced effects can be eliminated. Due to arbitrary positioning of the light source the cells can be chosen freely for examination.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa.de:bsz:14-qucosa-227816 |
| Date | 28 August 2017 |
| Creators | Wunsch, Alexander |
| Contributors | Technische Universität Dresden, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Prof. Dr. med. Richard H. W. Funk, Prof. Dr. med. Richard H. W. Funk, Prof. Dr. rer. nat. Henning Morawietz |
| Publisher | Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | deu |
| Detected Language | English |
| Type | doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
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