Proteínas sinalizadoras membranares são amplamente usadas por bactérias para adequar seu metabolismo a estímulos ambientais. Elas possuem ainda um grande potencial de aplicação, como em técnicas para controle de infecções e o desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas, como biossensores. Entretanto, pouco é conhecido sobre os mecanismos estruturais de transdução bacterianos. Em particular, pouco é descrito sobre proteínas sinalizadoras que possuem os domínios GGDEF e/ou EAL, responsáveis por desencadear a síntese, degradação ou captação da molécula c-di-GMP, um dos principais reguladores do metabolismo bacteriano. Por isso, esse estudo objetivou a caracterização de duas proteínas sinalizadoras transmembrana de Pseudomonas aeruginosa, codificadas nos genes PA0847 e PA3343 (HsbD), além de trazer análises por bioinformática de proteínas com domínios GGDEF e EAL consecutivos, comumente associados a membrana celular. É relatado que PA0847 e HsbD são ambas diguanilato ciclases (DGC), que impactam consideravelmente em fenótipos de P. aeruginosa, patógeno modelo de estudo e que infecta pacientes imunocomprometidos. Além disso, um estudo anterior mostrou a interação entre a porção citoplasmática de PA0847 e a região N-terminal de HsbD (HsbD-Nt), pela técnica de duplo híbrido. Nesse estudo, é mostrado que essa interação, associada à presença de um padrão conservado em HsbD-Nt, sugere a presença um sistema de controle específico de c-di-GMP. Ensaios in vitro de pulldown, termoforese e duplo híbrido, utilizando domínios isolados de PA0847, confirmaram a interação com HsbD-Nt e mostraram que a interação é dependente de todos os domínios de PA0847. Análises de massa molecular e de cinética enzimática mostraram que o HAMP eleva a atividade DGC e promove a formação de tetrâmeros. A presença de um transportador de sulfato compartilhando um operon com PA0847, associado a modelos computacionais da região periplasmática de PA0847, suportam o envolvimento de PA0847 na homeostase desse íon. Nesse estudo foram ainda identificados, por meio de análises de sequências, novos potenciais grupos de resíduos que estariam envolvidos na regulação de proteínas GGDEF-EAL. Análises adicionais de sequências e de estruturas indicaram também um mecanismo de dimerização alternativo para EALs, quando a região de dimerização está ausente. Estes resultados são inéditos e fornecem passos para uma melhor compreensão da sinalização bacteriana intermediada pelo c-di-GMP. / Membrane signaling protein are widely used by bacteria to adequate their metabolism of environmental cues. They present a great potential of applicability, such as techniques to control bacterial infections and development of biotecnological devices, for example in biosensors. However, little is known regarding the mechanisms of signal transduction in bacteria. In particular, about receptors that posses GGDEF and/or EAL domains, performing synthesis, degradation or recognition of c-di-GMP, which is one of the major bacteria metabolism regulators. For this reason, the present study aimed characterize two important transmembrane signaling proteins from Pseudomonas aeruginosa, coded in genes PA0847 and PA3343 (HsbD) and performed bioinformatic analysis of proteins with GGDEF and EAL in tandem, usually associated with membrane. Previous studies indicated that PA0847 and HsbD are both diguanylate cyclases (DGCs) that significantly impair phenotypes of P. aeruginosa, which is a model organism and common cause of infection in immunocompromised patients. In the present study we have shown that this interaction associated with the presence of a wellconserved pattern from HsbD-Nt, suggests the presence a system used for specific downregulation of c-di-GMP. Furthermore, using isolated domains of PA0847 in thermophoresis, pull down and two-hybrid confirmed the interaction and showed that the full PA0847 cytoplasmic is necessary to interaction with HsbD. Additional amalysis of molecular mass and enzyme kinetic showed that HAMP increases DGC activity, alters the co-purification patern of c-di-GMP and promotes tetramers formation in PA0847 soluble constructs. The presence of sulfate transporter in a common operon with PA0847, associated with computation model of periplasmatic region of PA0847 supports the relation of this protein in sulfate homeostasis. We also identified using new residues groups copled that are potential play roles in GGDEF-EAL proteins. We found by stuctural analisys alternative mechanisms of dimerization in EAL domais that do not posses dimerization site conserved. These results have not been presented elsewhere and provide insights into the bacterial signaling of c-di-GMP pathways.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-03052019-111248 |
| Date | 21 November 2018 |
| Creators | Silva, Éverton Edésio Dinis |
| Contributors | Navarro, Marcos Vicente de Albuquerque Salles |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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