[pt] Defensinas de planta, componentes inatos do sistema imune
das plantas, são
peptídeos antifúngicos, catiônicos, com estrutura primária
rica em cisteína.
Evidência dada pela literatura demonstrou que trechos de
esfingolipídios
complexos na membrana dos fungos, contendo
manosildiinositolfosforilceramida e glicosilceramida, são
sítios de ligação
seletivos para as defensinas de planta isoladas de Dahlia
merckii e Raphanus
sativus, respectivamente. Entretanto, desconhece-se se as
defensinas de planta
interagem direta ou indiretamente com alvos intracelulares
dos fungos. A fim de
identificar interações físicas e diretas do tipo proteína-
proteína, um sistema de
duplo-híbrido, em levedura, baseado no fator de transcrição
GAL4, foi
construído utilizando-se como isca, a defensina da planta
Pisum sativum,
Psd1 (Pisum sativum defensin 1). Proteínas alvos, capazes
de interagirem
com o peptídeo Psd1, foram detectadas através do
rastreamento de uma
biblioteca de cDNA do fungo Neurospora crassa. Do resultado
deste
rastreamento, nove dentre quinze candidatos, selecionados
pelo método do
duplo-híbrido, foram identificados como proteínas nucleares
da N. crassa. Um
clone, detectado com alta freqüência neste rastreamento,
apresentou homologia
de seqüência com a proteína ciclina F, relacionada com o
controle do ciclo
celular. O ensaio de co-purificação utilizando a proteína
conjugada a glutationa
S-transferase (GST) validou in vitro o resultado obtido
pelo sistema duplohíbrido.
Análise por microscopia de fluorescência da Psd1, conjugada
a FITC,
e, dos núcleos do fungo Fusarium solani, marcados com DAPI,
demonstrou in
vivo a co-localização da defensina de planta Psd1 com os
núcleos do fungo.
Para pesquisar o modo de ação da Psd1 ao nível do ciclo
celular, utilizou-se o
modelo multicelular da retina de ratos neonatais, em
desenvolvimento. Neste modelo, a migração nuclear
intercinética, correlacionada com as transições de
fase de S para M do ciclo celular, foi observada na
presença da Psd1. Verificouse
que Psd1 impediu a migração nuclear em neuroblastos,
parando o ciclo
celular na transição de S para G2. Estes resultados
revelaram modos de ação da
defensina de planta Psd1 sobre a fisiologia nuclear. / [en] Plant defensins, innate components of the plant immune
system, are cationic, antifungal peptides, with a cysteine-
rich primary structure. Evidence
from the literature demonstrated that fungus membrane
patches containing
complex sphingolipids, mannosyldiinositolphosphorylceramide
and
glucosylceramides, are selective binding sites for the
plant defensins isolated from
Dahlia merckii and Raphanus sativus, respectively. However,
whether the plant
defensins interact directly or indirectly with fungus
intracellular targets is
unknown. To identify direct physical protein-protein
interactions, a GAL4-based
yeast two-hybrid system was constructed, using the plant
peptide, Pisum sativum
defensin 1 (Psd1), as the bait protein. Target proteins,
capable of interacting with
the bait Psd1, were detected by screening a Neurospora
crassa cDNA library. In
this screening, nine out of fifteen two-hybrid candidates
were identified as N.
crassa nuclear proteins. One clone, detected with high
frequency in the screening,
presented sequence similarity to a N. crassa cyclin F,
related to the cell cycle
control. The GST pull- down co purification assay
corroborated this two-hybrid
result in vitro. Fluorescence microscopy analysis of FITC-
conjugated Psd1 and
DAPI-stained Fusarium solani nuclei demonstrated in vivo
the co-localization of
the plant peptide Psd1 and the fungus nuclei. We used the
developing retina of
neonatal rats as a multicellular model to study Psd1 mode
of action at the cell
cycle level. In this model, we observed in vivo the
interkinetic nuclear migration,
correlated to the transitions from S to M-phase of the cell
cycle, in the presence of the Psd1 peptide. It was shown
that Psd1 impaired nuclear migration of
neuroblasts by arresting the cell cycle at the S to G2-
phase transition. These
results revealed modes of action of the plant defensin Psd1
upon the nuclear
physiology.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:puc-rio.br/oai:MAXWELL.puc-rio.br:9447 |
| Date | 08 January 2007 |
| Creators | DENISE DA SILVEIRA LOBO |
| Contributors | REINALDO CALIXTO DE CAMPOS |
| Publisher | MAXWELL |
| Source Sets | PUC Rio |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | TEXTO |
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