Helicoverpa armigera et Epiphyas postvittana, deux insectes nuisibles pour l'agriculture, ont développé des résistances contre la plupart des insecticides connus. Les lipides étant les constituants majeurs de leur régime alimentaire, les fonctions digestives des lipases deviennent alors une cible privilégiée pour l'élaboration de nouveaux insecticides. L'identification récente de gènes codant pour l'expression de protéines potentiellement actives et inactives apparentées aux lipases pancréatiques (PLRP) dans le tractus digestif de ces deux insectes et dont le niveau de transcription varie en fonction de leur régime alimentaire a ouvert un nouveau champ de recherche. Dans le but de contribuer à cette thématique, nous avons construit cinq lipases recombinantes d'E. postvittana (EpLIPs) et testé leur expression dans trois systèmes différents (E.coli, P.pastoris et bacculovirus). Le tractus digestif de Helicoverpa armigera a été étudié par chromatographie échangeuse d'ions et les différentes protéines séparées ont été testées en spectrométrie de masse et sur pHstat pour l'activité. Les résultats obtenus ont permis de mettre en évidence, pour la première fois, la présence à la fois d'une lipase active et d'une lipase inactive dans le tractus digestif d'un lépidoptère. Par ailleurs, la caractérisation biochimique d'un mutant GPLRP2-Δ β9 a été faite dans le but de comprendre l'effet de cette boucle, partiellement délétée dans les lipases d'insectes, dans la spécificité du substrat. Nous avons pu montrer que cette boucle β9 est essentielle pour la stabilisation de la chaîne acyle durant la réaction de lipolyse. / Helicoverpa armigera and Epiphyas postvittana, two major pest crops, have developed resistances against most of the known insecticides. Lipids being a major component of insect diet, digestive function of lipase are a target of choice for new insecticide design. The recent identification of active and inactive pancreatic lipase related protein (PLRP) genes in those two insects midgut, with a level of transcription depending on the diet, opened the field of insect digestive lipase study. In order to contribute to this thematic, we built five recombinants lipase from E. postvittana (EpLIPs) and tested their expression in three different systems (E.coli, P.pastoris and bacculovirus). Protein structure prediction of EpLIPs allowed us to develop some functional hypothesis enlightening the role of inactive lipase in lipid transport. H. armigera midgut contents were separated through a one step purification chromatography and the different fractions were tested for activity and mass spectrometry. The results obtained gave the first evidence of the presence of both an active and an inactive lipase in lepidopteran midgut. In addition to this work, a biochemical characterisation of a β9 GPLRP2 mutant was carried out to understand the effect of this loop, partially deleted in insect lipase, in substrate specificity. The result shows that β9 loop is essential for stabilizing the leaving acyl chain during the lipolysis reaction.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2013AIXM4019 |
| Date | 29 May 2013 |
| Creators | Dridi, Kaouther |
| Contributors | Aix-Marseille, Carrière, Frédéric |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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