The establishment of genomic approaches including the sequence determination of complete bacterial genomes started a new era in microbiological research. Since then more than two hundred prokaryotic and eukaryotic genomes have been completely sequenced, and there are additional complete genome projects including different bacterial species and strains in progress (http://www.tigr.org, http://www.sanger.ac.uk). The continously growing amount of bacterial DNA sequence information gives us also the possibility to gain deeper insight into bacterial pathogenesis. With the help of comparative genomics, microbiological research can focus on those DNA sequences that are present in pathogenic bacteria but are absent in non-pathogenic strains. With this knowledge and with the help of molecular biological methods such as PCR,DNA-chip technology, subtractive hybridisation, transcriptomics and proteomics we can analyse in detail what makes a particular bacterial strain pathogenic. This knowledge also gives us the possibility to develop new vaccines, therapeutic approaches or diagnostic tools. The aim of this work was the structural and functional analysis of DNA regions of uropathogenic Escherichia coli strain 536 that belong to the flexible E. coli gene pool. The first part of this thesis focused on the identification and structural characterisation of pathogenicity island V of strain 536 (PAI V536). PAI V536 is integrated at the pheV tRNA gene at 64 minutes of the E. coli K-12 chromosome. In addition to the intact pheV tRNA gene, a truncated copy ('pheV) that represents the last 22 bp of this gene’s 3'-end was identified 49 kb downstream of pheV on PAI V536. The analysis of the DNA sequence flanked by pheV and 'pheV revealed characteristics that are typical of PAIs. This DNA region exhibits homology to IS-elements and prophages and also comprises determinants coding for the Pix fimbriae, a phosphoglycerate transport system, an autotransporter, as well as for hypothetical proteins. Downstream of 'pheV, the K15 capsule determinant (kpsK15) of this strain is located. Structural analysis of the 20-kb kpsK15 locus revealed a so far unknown genetic organisation indicative of recombination events between a group 2 and group 3 capsule gene cluster. Downstream of the capsule determinant, the genes encoding a type II secretion system (general secretion pathway -GSP) are located on PAI V536. The K15 capsule locus was functionally characterized. Specific inactivation of each of the regions 1 to 3 of the kpsK15 gene cluster, and the use of a K15 capsule-specific antiserum demonstrated that this determinant is the functional K15 capsule locus of strain 536. It has been shown in an experimental murine model of ascending urinary tract infection with suckling mice that the K15 capsule contributes to urovirulence. Interestingly, the K15 capsule is not involved in serum resistance of strain 536. Inactivation of the PAI V536-encoded type II secretion system excluded a role of this general secretion pathway for capsule biosynthesis and virulence of strain 536 in the murine ascending urinary tract infection model. In the second part of the thesis, the transferability of PAIs was further investigated. Using PAI II536 as a model, mobilisation of this island from strain 536 into suitable recipient strains was investigated. For this purpose, an antibiotic resistance cassette, the R6K origin of replication as well as plasmid pGP704 carrying the mobilisation region of plasmid RP4 have been inserted into PAI II536. Transformation with the helper plasmid RP4, resulted a derivative of strain 536 that was used as a donor for conjugation experiments, while for recipient the pir + laboratory strain SY327 was used. After deletion the circularised PAI II536 was mobilised with the help of the conjugative helper plasmid (RP4) into the recipient laboratory strain SY327. The frequency of this event was about 10-8. It was also demonstrated that in the transconjugant strains the mobilized PAI II536 could be permanently present as a circular form and also can be integrated into the chromosome at the same chromosomal insertion site (leuX) as in the donor strain 536. Furthermore, after mobilisation and chromosomal integration of PAI II536 it was possible to remobilise this PAI back to a PAI II536-negative derivative of strain 536. The results obtained in this thesis increase our knowledge of the structure and function of a pathogenicity island of uropathogenic E. coli strain 536 and shed some light on the mechanisms contributing to genome plasticity and evolution of pathogenic E. coli variants. / Mit der Einführung von Genomanalytik einschließlich der Sequenzbestimmung bakterieller Genome, startete eine neue Ära in der mikrobiologischen Forschung. Seit Beginn dieser Ära sind mehr als 200 prokaryotische und eukaryotische Genome komplett sequenziert worden. Weitere Genomanalysen über verschiedene Bakterienspezies und Stämme sind in Arbeit(http://www.tigr.org, http://www.sanger.ac.uk). Durch die stetig anwachsende Menge an Informationen über bakterielle DNA Sequenzen, sind wir in der Lage, einen tieferen Einblick in die bakterielle Pathogenität zu bekommen. Mittels vergleichender Genomanalyse kann sich die mikrobiologische Forschung auf bestimmte DNA Sequenzen konzentrieren, welche in pathogenen Stämmen vorhanden sind, in apathogenen Stämmen aber fehlen. Mit diesem Wissen und durch molekularbiologische Methoden wie Polymerase Kettenreaktion, DNA-Chip- Technologie, Subtraktiver Hybridisierung, Transkriptom- und Proteom-Analyse können wir im Detail untersuchen, welche Faktoren für die Pathogenität eines speziellen Bakterienstammes verantwortlich sind. Diese Erkenntnisse geben uns auch die Möglichkeit neue Impfstoffe, therapeutische Verfahren und diagnostische Werkzeuge zu entwickeln. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Struktur und Funktion von DNA-Regionen des uropathogenen Escherichia coli Stammes 536, welche zum flexiblen Genpool von E. coli gehören. Der erste Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Identifizierung und strukturelle Charakterisierung der Pathogenitätsinsel V des E. coli Stammes 536 (PAI V536). Die Integrationsstelle von PAI V536 liegt im E. coli K-12 Chromosom beim tRNA Gen pheV bei 64 Minuten. Zusätzlich zum intakten pheV tRNA Gen wurde auf der PAI V536 eine verkürzte Kopie des Gens (´pheV) 49 kb stromabwärts von pheV identifiziert. Diese Kopie repräsentiert die letzten 22 bp des 3´-Endes von pheV. Eine Analyse der von pheV und ´pheV eingeschlossenen DNASequenz zeigte typische Eigenschaften einer Pathogenitätsinsel. Die untersuchte DNA-Region besitzt Homologie zu IS-Elementen und Prophagen, außerdem beinhaltet sie Determinanten, die für Pix Fimbrien, ein Phosphoglycerat-Transportsystem, einen Autotransporter sowie für unbekannte Proteine kodieren können. Stromabwärts von ´pheV liegt die K15 Kapsel Determinante (kpsK15) des E. coli Stammes 536. Eine strukturelle Analyse des 20-kb kpsK15 Lokus zeigte eine bislang unbekannte genetische Anordnung, welche auf ein Rekombinationsereignis zwischen einem Gruppe 2 und einem Gruppe 3 Kapsel Gencluster hinweist. Stromabwärts der Kapsel Determinante sind auf der PAI V Gene lokalisiert, welche für ein Typ II Sekretionssystem („General Secretion Pathway“) kodieren. Der K15 Kapsel Lokus wurde funktional charakterisiert. Die spezifische Inaktivierung der Regionen 1 bis 3 des kpsK15 Genclusters und die Verwendung eines K15 Kapsel-spezifischen Antiserums zeigten, daß es sich tatsächlich um den funktionalen K15 Kapsellokus des E. coli Stammes 536 handelt. Im Tiermodel einer aufsteigenden Harnwegsinfektion bei neugeborenen und säugenden Mäusen, konnte gezeigt werden, daß die K15 Kapsel zur Urovirulenz beiträgt. Interessanterweise trägt die K15 Kapsel des E. coli Stammes 536 nicht zur Serumresistenz bei. Die Inaktivierung des in der PAI V536 kodierten Typ II Sekretionssystems schließt eine Rolle des „General Secretion Pathways“ bei der Kapsel Biosynthese und bei der Virulenz des E. coli Stammes 536 im Mausinfektionsmodel einer aufsteigenden Harnwegsinfektion aus. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Mobilisierung von Pathogenitätsinseln untersucht. PAI II536 wurde als Model genutzt, um den Transfer einer PAI von E. coli 536 in einen geeigneten Rezipientenstamm zu zeigen. Zu diesem Zweck wurde eine Antibiotikaresistenzkassette, der Replikationsstartpunkt RK6 und das Plasmid pGP704, das die Mobilisierungsregion des Plamides RP4 besitzt, in die PAI II536 inseriert. Nach Transformation des Helferplasmids RP4 wurde das daraus resultierende Derivat des E. coli Stammes 536 als Donor für Konjugationsexperimente mit dem Rezipientenstamm SY327 eingesetzt. Diese Mobilisierungsexperimente zeigten, daß die gesamte PAI II536 mit einer Frequenz von ungefähr 10-8 in einen Rezipientenstamm übertragen werden kann. In den Transkonjuganten konnte PAI II536 an derselben chromosomalen Insertionsstelle (leuX) wie im Donorstamm E. coli 536 inserieren. Weiterhin war es möglich PAI II536, nach Mobilisierung und chromosomaler Integration in einem Rezipientenstamm, wieder zurück in ein PAI II536 negatives Derivat von E. coli 536 zu transferieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern unser Wissen hinsichtlich der Struktur und Funktion einer Pathogenitätsinsel des uropathogenen E. coli Stammes 536 und geben Aufschluß über den Mechanismus, der zur Genomplastizität und Evolution pathogener E. coli Varianten beiträgt.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:1212 |
| Date | January 2005 |
| Creators | Schneider, György |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0029 seconds