La microscopie de super-résolution PALM (microscopie de localisation après photo-activation) est un outil performant pour l'étude des cellules à l'échelle nanométrique. Dans ses applications avancées, la microscopie PALM permet l'étude quantitative et dynamique des objets et événements biologiques. Ces applications sont cependant limitées par le comportement photophysique complexe des protéines fluorescentes photoconvertibles vert à rouge (PCFPs) utilisées comme marqueurs. En particulier, les transitions répétées et stochastiques des PCFPs entre un état sombre et un état fluorescent (scintillement) ainsi que l'incomplétude de photoconversion compliquent l'extraction d'informations quantitatives.Nos travaux combinant cristallographie aux rayons X des protéines et microscopie de localisation ont permis de mettre en évidence le rôle central d'un acide aminé conservé au sein des PCFPs, l'arginine 66, dans le contrôle du scintillement et du photoblanchiment de la forme rouge de deux PCFPs populaires: mEos2 et Dendra2.D'autre part, des résultats préliminaires suggèrent que dans leur formes vertes et dans les conditions d'illumination classiques PALM, les PCFPs entrent dans un état sombre de long temps de vie ce qui ralentit la photoconversion.Nos résultats ouvrent la porte à la conception raisonnée de nouvelles PCFPs optimisées pour les applications quantitatives et dynamiques du PALM. / Super-resolution PALM microscopy (photoactivated localization microscopy) is a powerful tool to investigate the cells with nanoscopic accuracy. Advanced PALM microscopy allows to quantitatively and dynamically study biological objects and events. These applications are nevertheless limited by the complex photophysical behavior of the green-to-red photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) used as markers. In particular, PCFPs red forms repeated and stochastic transitions between a fluorescent and a dark state (blinking) as well as photoconversion uncompleteness complicate the extraction of quantitative information.Our study, by combining X-ray crystallography and localization microscopy, evidences that a single aminoacid well conserved among PCFPs, the arginine 66, controls the blinking and photobleaching behavior of two popular PCFPs: mEos2 and Dendra2.Preliminary results suggest that in their green forms and under PALM classical illumination conditions, PCFPs switch to a long-lived dark state resulting in a photoconversion slowing down.Our results open the door to future rational engineering of enhanced PCFPs for quantitative and dynamic PALM.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2016GREAV015 |
| Date | 02 December 2016 |
| Creators | Berardozzi, Romain |
| Contributors | Grenoble Alpes, Bourgeois, Dominique |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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