Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Jaqueline Oliveira (jaqueoliveiram@gmail.com) on 2008-12-11T19:02:46Z
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DISSERTACAO_2008_JulianaAmorimAraujo.pdf: 3037793 bytes, checksum: a7399845548557e765e50c02f6d3d986 (MD5) / A coagulação enzimática do leite para fabricação de queijo envolve a quebra de
uma ligação peptídica da caseína por uma protease aspártica. Tradicionalmente, esta
clivagem é feita em escala industrial pela ação da quimosina bovina que combina uma
forte atividade de coagulação do leite com uma baixa atividade proteolítica. No presente
estudo, é relatada a expressão, purificação e caracterização de quimosina recombinante
bovina na levedura metilotrófica Pichia pastoris. Para alcançar altos níveis de produção, o cDNA do fragmento codante da pró-quimosina B bovina foi desenhado e sintetizado in vitro otimizando o codon usage para a expressão em P. pastoris. O gene sintético (CHYMb) foi clonado em vetores de expressão contendo os promotores PGK1
(expressão constitutiva) e AOX1 (expressão induzida) seguindo-se integração no genoma da levedura. Os clones transformantes com maior produção enzimática de cada sistema (P1 e A3, respectivamente) foram analisados em culturas simultâneas para comparação da produção enzimática. Maiores níveis de atividade de quimosina foram observados no clone sob o comando do promotor PGK1, que apresentou alta produção durante toda a cultura. Uma otimização na produção enzimática foi desenvolvida através de planejamentos fatoriais. A influência da densidade celular inicial, metanol e concentração da fonte de nitrogênio foram avaliados para aumentar a produção do clone
A3. A interação dos fatores densidade celular inicial e concentração de metanol foi
determinada como sendo o parâmetro mais importante, dobrando a produção. A influência de diferentes concentrações da fonte de nitrogênio e carbono, previamente
selecionados (farelo de soja e açúcar invertido), foi também analisada para aumentar a produção enzimática no clone P1. Foi demonstrado por análise estatística que maiores concentrações de cada fator aumentam a produção. O perfil de atividade enzimática foi avaliada em fermentador com as condições determinadas nas otimizações. A atividade encontrada nos dois casos (A3 e P1) foi superior àquelas encontradas na fermentação em frascos. A quimosina recombinante foi posteriormente purificada apenas por uma etapa de cromatografia de exclusão molecular. Foi demonstrada a presença de enzima já processada no sobrenadante da cultura e uma fração de proteínas glicosiladas. A especificidade pela caseína foi demonstrada ser semelhante à quimosina comercial recombinante produzida por Aspergillus niger (Chr. Hansen). A alta produção de quimosina recombinante com alta especificidade em P. pastoris faz esse sistema de expressão atrativo para produção industrial desta enzima.
_______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Enzymatic milk coagulation for cheese manufacturing involves the cleavage of
the scissile bond in casein by an aspartic protease. Bovine chymosin B is commonly
used at the industrial level for milk coagulation because it combines a strong clotting activity with a low general proteolytic activity. In the present study, we report the expression, purification and characterization of recombinant chymosin B expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. To achieve high levels of production, the cDNA fragment coding for prochymosin was designed and synthesized based on codon
usage optimization for expression in P. pastoris. The synthetic gene (CHYMb) was
cloned into expression vectors based on the PGK1 promoter (constitutive expression)
and AOX1 promoter (inducible expression). The resulted constructs were integrated in
the yeast genome. Transformant clones producing high levels of enzyme activity from
each system (P1 and A3, respectively) were analyzed in a simultaneous culture for comparison of enzymatic production. High levels of chymosin activity were observed in
the clone controlled by the PGK1 promoter which showed high production levels throughout the culture. Optimization for enzymatic production was developed through
factorial design. The influence of the initial cellular density, methanol and nitrogen
source concentration were accessed for enzymatic production from clone A3. The
interaction of the initial cellular density and methanol concentration was responsible for
doubling enzyme production. The influence of different concentrations of nitrogen and
carbon sources (soy extract and inverted sugar, respectively) was also observed to
increase enzymatic production in clone P1. Statistic analysis demonstrated that higher
concentrations of each factor increased enzyme production. The profile of enzymatic
activity was evaluated in fermentors under the conditions determined during optimizations. In this case, the activities observed in clones A3 and P1 were superior to those found when theses clones were grown in shake flasks. The recombinant chymosin was purified by a single molecular exclusion chromatographic step. Purified enzyme derived from supernatant fraction was shown to be present in its processed form and a fraction of glycosylated protein was also detected. The specificity for casein was shown to be similar to that from commercial recombinant chymosin produced by Aspergillus niger (Chr. Hansen). The high production and high specificity of recombinant chymosin derived from P. pastoris renders this expression system as an attractive alternative for large scale industrial production of this enzyme.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/1328 |
| Date | 15 February 2008 |
| Creators | Araújo, Juliana de Amorim |
| Contributors | Torres, Fernando Araripe Gonçalves |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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