As enzimas desempenham papel fisiológico fundamental nos organismos, seja em condições normais e patológicas, o que as tornam atrativos alvos para intervenções terapêuticas. Pequenas moléculas capazes de inibir enzimas alvos são utilizadas para o tratamento de diversas doenças inflamatórias, câncer, AIDS, entre outras. Contudo, a identificação de pequenas moléculas inibidores ainda é uma etapa limitante no desenvolvimento de fármacos. Nesse contexto, o aprimoramento e novos ensaios robustos e confiáveis para acelerar a descoberta e a caracterização de novos inibidores é de extrema relevância. Nesta tese apresentamos o desenvolvimento de apropriados métodos para a quantificação direta da atividade das enzimas alvos Nucleosídeo Difosfato Quinase B (NDKb), humana (NME2) e de Leishmania major (LmNDKb), livres em solução ou imobilizadas em colunas capilares (ICER). A separação dos produtos e substratos da reação foi realizada por cromatografia de par iônico, que possibilitou a quantificação direta da atividade enzimática da NDKb livre em solução, método 1D-LC-UV. Já para a quantificação da atividade das enzimas imobilizadas foi elaborado um método on-line ICER-LC-UV, no qual a reação enzimática do ICER foi transferida à coluna analítica, permitindo a separação e quantificação da atividade de fosfotransferência. Utilizando esses métodos foi possível determinar o pH ótimo e os parâmetros cinéticos das enzimas livres e imobilizadas. Inibidores de NDKb de diferentes potências e mecanismos de ação foram utilizados para modulação do sistema ICER-LC-UV como ensaio de triagem de inibidores. O (-)-Epicatequina galato (ECG) foi utilizado como prova de conceito, para validar a aplicação do método on-line ICER-LC-UV na identificação e caracterização de inibidores para as enzimas alvo NME2 e LmNDKb. Em suma, a quantificação direta associada ao uso de enzimas imobilizadas representa um grande avanço aos métodos consolidados para o monitoramento da atividade enzimática e triagem de inibidores das enzimas alvo. / Enzymes play a key physiological role in organisms, either under normal and pathological conditions, which make them attractive targets for therapeutic interventions. Small molecules capable to inhibit specific target enzymes are used for the treatment of several inflammatory diseases, cancer, AIDS, among others. However, to identify small inhibitory molecules is still a limiting step in drugs discovery. In this context, the improvement and development of robust and reliable novel assays to accelerate the discovery and characterization of new inhibitors have become extremely relevant. This study describes an appropriate direct method to quantify the enzymatic activity of Nucleoside Diphosphate Kinase B (NDKb) from human (NME2) and Leishmania major (LmNDKb). It can be applied to free enzyme in solution or immobilized enzyme into silica capillary (ICER). The separation of both the substrates and products was achieved using ion-pair chromatography, it can be applied to direct quantification of free NDKb activity, method 1D-LC-UV. In order to quantify the activity of the immobilized enzymes, an on-line ICER-LC-UV method was developed. Initially, the enzymatic catalysis occurred into the ICER. Sequentially, the reaction mixture was transferred to an analytical column, where analytes were separated. From this method, it was possible to determine the optimum pH and kinetic parameters for the immobilized enzymes. Well stablished NDKb inhibitors with different strenght and mechanisms of action were used to modulate the on-line ICER-LC-UV method as an inhibitor screening assay. (-)-Epicatechin gallate was used as proof of concept in order to validate the application of the on-line ICER-LC-UV method to identify and characterize the target\'s enzymes NME2 and LmNDKb inhibitors. In summary, the direct quantification method coupled to the immobilized enzymes increases the likelihood of identifying the enzymatic activity and screening of inhibitors of the target enzymes when compared methods well described in the literature.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-10082018-153529 |
| Date | 11 May 2018 |
| Creators | Lima, Juliana Maria de |
| Contributors | Cardoso, Carmen Lúcia |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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