L’apoptose est une forme de mort cellulaire essentielle au développement et au
maintien de l’homéostase chez les animaux multicellulaires. La machinerie apoptotiq ue
requiert la participation des caspases, des protéases conservées dans l’évolution et celle des
organelles cytoplasmiques. Les lysosomes subissent des ruptures partielles, labilisation de
la membrane lysosomale (LML), qui entraînent l’activation des cathepsines dans le
cytoplasme de cellules cancéreuses humaines en apoptose induite par la camptothecin
(CPT), incluant les histiocytes humains U-937. Ces modifications lysosomales se
manifestent tôt durant l’activation de l’apoptose, concomitamment avec la perméabilisation
de la mitochondrie et l’activation des caspases.
Une étude protéomique quantitative et comparative a permis d’identifier des
changements précoces dans l’expression/localisation de protéines lysosomales de cellules
U-937 en apoptose. Lors de deux expériences indépendantes, sur plus de 538 protéines
lysosomales identifiées et quantifiées grâce au marquage isobarique iTRAQ et LC-ESIMS/
MS, 18 protéines augmentent et 9 diminuent dans les lysosomes purifiés de cellules en
cours d’apoptose comparativement aux cellules contrôles. Les candidats validés par
immuno-buvardage et microscopie confocale incluent le stérol-4-alpha-carboxylate 3-
déhydrogénase, le prosaposin et la protéine kinase C delta (PKC-d). Des expériences
fonctionnelles ont démontrées que la translocation de PKC-d aux lysosomes est requise
pour la LML puisque la réduction de son expression par ARN interférents ou l’inhibition de
son activité à l’aide du rottlerin empêche la LML lors de l’apoptose induite par la CPT. La
translocation de PKC-d aux lysosomes conduit à la phosphorylation et l’activation de la
sphingomyelinase acide lysosomale (ASM), et à l’accroissement subséquent du contenu en
céramide (CER) à la membrane lysosomale. Cette accumulation de CER endogène aux
lysosomes est un évènement critique pour la LML induite par la CPT car l’inhibition de
l’activité de PKC-d ou de ASM diminue la formation de CER et la LML.Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme par lequel la PKC-d active
l’ASM qui conduit à son tour à l’accumulation de CER à la membrane lysosomale et
déclenche la LML et l’activation de la voie lysosomale de l’apoptose induite par la CPT. En somme, ce mécanisme confirme l’importance du métabolisme des sphingolipides dans
l’activation de la voie lysosomale de l’apoptose. / Apoptosis is a distinct form of regulated cell death which is essential for the
development and homeostasis maintenance of multicellular animals. Apoptosis is an
evolutionary conserved process involving a specific molecular pathway, known as the
caspase cascade, and the different cytoplasmic organelles. A lysosomal pathway,
characterized by partial rupture, labilization of lysosomal membranes (LML), and cathepsin
activation in the cytoplasm, is evoked during camptothecin-induced apoptosis in human
cancer cells, including human histiocytic lymphoma U-937 cells. These lysosomal events
begin rapidly and simultaneously with mitochondrial permeabilization and caspase
activation within 3 h after drug treatment.
Comparative and quantitative proteome analyses were performed to identify early
changes in lysosomal protein expression/localization from U-937 cells undergoing
apoptosis. In two independent experiments, among a total of more than 538 proteins
putatively identified and quantitated by iTRAQ isobaric labelling and LC-ESI-MS/MS, 18
proteins were found to be upregulated and 9 downregulated in lysosomes purified from
early apoptotic compared to control cells. Protein expression was validated by Western
blotting on enriched lysosome fractions, and protein localization confirmed by fluorescence
confocal microscopy of representative protein candidates, whose functions are associated
with lysosomal membrane fluidity and dynamics. These include sterol-4-alpha-carboxylate
3-dehydrogenase (NSDHL), prosaposin (PSAP) and protein kinase C delta (PKC-d).
Functional experiments demonstrate that PKC-d translocation to lysosomes is required for
LML, as silencing its expression with RNA interference or suppressing its activity with the
inhibitor rottlerin prevents CPT-induced LLM. PKC-d translocation to lysosomes is
associated with lysosomal acidic sphingomyelinase (ASM) phosphorylation and activation,
which in turn leads to an increase of ceramide (CER) content at lysosomes. The
accumulation of endogenous CER at lysosomes is a critical event for CPT-induced LLM as
suppressing PKC-d or ASM activity reduces both CPT-mediated CER generation at
lysosomes and CPT-induced LLM.These findings reveal a novel mechanism by which PKC-d mediates ASM
phosphorylation/activation and CER accumulation at lysosomes in CPT-induced LLM,
rapidly activating the lysosomal pathway of apoptosis after CPT treatment. Taken together,
these results confirm the importance of sphingolipid metabolism in the activation of the
lysosomal pathway of apoptosis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/4146 |
| Date | 08 1900 |
| Creators | Parent, Nicolas |
| Contributors | Bertrand, Richard |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation |
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