O músculo esquelético é o tecido mais abundante do organismo, é importante em diversas habilidades básicas nas atividades de vida diária, como: movimento, postura corporal e respiração, além de outros processos fisiológicos importantes para manutenção do equilíbrio metabólico e defesa imunológica. Para se manter em adequado funcionamento, o músculo esquelético possui uma alta plasticidade, remodelando sua estrutura e função de acordo com as exigências do ambiente. Os microRNAs são pequenos RNAs não codificadores de proteínas que podem regular a expressão gênica a nível pós-transcricional. Nas últimas décadas o conhecimento dos microRNAs na biologia do músculo esquelético vem abrindo portas para novas abordagens que visam otimizar a boa saúde da musculatura esquelética. Neste trabalho, nosso principal objetivo foi identificar e caracterizar microRNAs com potencial de modulação da regeneração e massa muscular esquelética. Utilizamos uma análise in silico para identificar os microRNAs que tem como alvo predito genes associados a vias que regulam a regeneração e massa muscular, em seguida manipulamos in vitro (células C2C12) e in vivo (camundongos C57BL/6) a expressão desses microRNAs, analisando a expressão desses genes e as consequências nas células e no tecido muscular. Na primeira parte deste trabalho, analisamos a hipótese de que certos microRNAs poderiam regular a expressão de MuRF1 e MuRF2 (E3-ligase importantes para o processo de regeneração muscular). Identificamos os microRNAs miR-29c e miR-101a que têm como alvo predito MuRF1, e miR-133a e miR-133b que tem como alvo predito MuRF2. MuRF1 é induzido nos primeiros estágios do processo de regeneração muscular e seus miRs potencialmente reguladores são reprimidos durante esse processo. A superexpressão de miR-29c e miR-101a reduz a expressão de MuRF1 em células C2C12, enquanto que, em um ensaio de luciferase, validamos MuRF1 como alvo direto apenas do miR-29c. Além disso, a superexpressão de miR-29c durante a diferenciação de células C2C12 promove a miogênese, com aumento do diâmetro e índice de fusão de miotubos, enquanto que a superexpressão do miR-101a provocou uma redução no diâmetro dos miotubos. Na segunda parte deste trabalho, identificamos in silico o miR-29c como um potencial regulador da massa muscular esquelética, em seguida através de um método de entrega gênica por meio de eletroporação, superexpressamos o miR-29c no músculo de camundongos. A superexpressão do miR-29c, promoveu um aumento da massa e do número de sarcomeros em serie, com ganho de força e função no músculo e esse efeito foi acompanhado de um remodelamento tecidual com aumento do número de células satélite ativadas. Tomados juntos, nossos resultados revelam que o miR-29c tem um efeito hipertrófico com ganho de função. A superexpressão deste microRNA pode ser uma ferramententa útil para futuras abordagens terapêuticas que visem a manipulação da massa muscular esquelética. / The skeletal muscle is the body most abundant tissue. It plays an important role in daily life activities, such as movement, posture, and breathing. In addition, this tissue is crucial at physiological processes like metabolic equilibrium and immune defense. The substantial adaptability in response to environmental change marks skeletal muscle as a plastic organ. This plasticity could be coordinated by microRNAs, those are small non-protein-coding RNAs that regulate post-transcriptional gene expression. This knowledge has fostered new approaches that aim to optimize the skeletal muscle health. Thus, in this work, we intended to identify and characterize microRNAs that modulate the muscle mass and the regeneration process. An in silico analyses has allowed the identification of microRNAs who possibly bind genes from pathways of skeletal muscle mass control and regeneration. After, we manipulated the expression of those microRNAs on C2C12 cells and C57BL/6 mice. Finally, we measured the transcriptional levels of target genes and the impact of these alterations on the cells and on muscle tissue. In the first section of this work, we hypothesized that microRNAs could regulate MURF1 and MURF2 expression, both E3-ligases important for the regeneration process. In our analysis, MURF1 was a predictable target of miR-29c and miR-101a while for MURF2 were identified miR-133a and 133b. During the regeneration process, MURF1 is up-regulated and its predicted target microRNAs are downregulated. In this context the hyperexpression of both miR-29c and miR-101a in C2C12 cells induced MURF1 down-regulation. Furthermore, miR-29c promotes myogenesis with an increase in myotubes diameter and fusion index. In contrast, miR-101a expression reduces myotubes diameter with no change at the fusion index. Lastly, luciferase assay validated only miR-29c directly target MURF1 3`UTR. In the second section of this work, we identified miR-29c as a potential regulator of skeletal muscle mass. Then through gene delivery by electroporation, we induce miR-29c overexpression in mice skeletal muscle. This procedure promoted an increase in muscle mass as well as a gain in strength, endurance and sarcomere number, furthermore the number of activated satellite cells. Taken together our results found that miR-29c has a hypertrophic effect with gain in muscle function. Thus, the overexpression of this microRNA could be a useful tool for future therapeutics that manipulate muscle mass.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-30072019-140841 |
| Date | 11 April 2019 |
| Creators | Silva, William José da |
| Contributors | Moriscot, Anselmo Sigari |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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