Poldip2 est une protéine ubiquitaire initialement identifiée comme étant un partenaire de la sous unité p50 de la polymerase δ intervenant dans la réplication et la réparation de l’ADN. Depuis sa découverte en 2003, beaucoup d’autres partenaires et fonctions lui ont été attribués. Elle joue, entre autre, un rôle régulateur de l’isoforme NADPH oxydase NOX4. A ce jour, le mode d’action de cette régulation n’a pas encore été identifié. Seul fait connu est que Poldip2 augmente l’activité de NOX4 en s’associant au partenaire membranaire de NOX4, la protéine p22phox. L’association de p22phox à d’autres isoformes de NADPH Oxydase (NOX1, NOX2 ou NOX3) suggère une interaction possible entre ces derniers et Poldip2. Par ailleurs la co-localisation de NOX4 et NOX2 dans plusieurs types cellulaires, tels que les cellules du muscle lisse et l’endothélium mais également la coexpression de Poldip2 et NOX2 dans les artérioles rénale font de NOX2 un bon candidat pour l’étude de l’effet régulateur possible de Poldip2 de cet isoforme. Dans cette perspective, la protéine recombinante Poldip2 (rat) a été produite de manière hétérologue dans un système d’expression de levure P. pastoris. Grace à un vecteur d’expression spécifique de cette levure, Poldip2 est sécrété dans le milieu extracellulaire. La protéine a été purifiée à partir du milieu de culture. L’analyse de la séquence par spectrométrie de masse a permis de confirmer l’identité du Poldip2 recombinant produit par la levure. Après avoir caractérisé structuralement Poldip2 et confirmé sa capacité à augmenter l’activité de NOX4, nous avons étudié son effet sur NOX2 des phagocytes. De manière surprenante, nos études en système cell-free ont montré des propriétés inhibitrices de Poldip2 sur NOX2 avec des interactions privilégiées avec certaines des composantes du complexe oxydase. Nos résultats suggèrent que l’interaction de Poldip2 avec le complexe pourrait constituer une nouvelle voie de régulation de NOX2 en perturbant l’assemblage du complexe NADPH oxydase. / Poldip2 is an ubiquitous protein initially identified as a partner for polymerase δ p50 subunit and is involved in DNA replication and repairing. Since its discovery in 2003, many partners and functions has been assigned to it. Poldip2 is also involved in NADPH Oxidase NOX4 isoform regulation. The enhancement of NOX4 activity was attributed to Poldip2 interaction with the membrane partner p22phox. However the mechanism by which it regulates NOX4 has not been identified yet. The association of p22phox with other Nox isoform (NOX1, NOX2 or NOX3) questions the possible interaction of Poldip2 with NOX2. Furthermore the colocalization of NOX4 and NOX2 in several cell types as the smouth muscle cells and endothelium cells but also Poldip2 and NOX2 coexpression in renal arterioles, makes NOX2 a good candidate for studying the possible regulatory effect of Poldip2 on the NOX2 isoform. On this purpose the recombinant protein Poldip2 (rat) was produced in the yeast P. pastoris. Using a specific expression vector Poldip2 was secreted in the extracellular media. The protein was purified from culture media. Sequence analysis by mass spectrometry allowed to confirm the recombinant protein identity produced in yeast. After the structural characterization of poldip2 and the confirmation of its functionality on NOX4, the protein was used to study its effect on NOX2 phagocyte. Surprisingly our study on cell free assay shows that Poldip2 has inhibiting properties regarding NOX2 and interacts in a privileged manner with certain components of the NADPH Oxidase complex. Our result suggest that the interaction of Poldip2 and the complex might constitute a new regulation for NOX2 by disturbing the NADPH Oxidase assembly.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2019SACLS291 |
| Date | 17 October 2019 |
| Creators | Bouraoui, Aicha |
| Contributors | Paris Saclay, Baciou, Laura |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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