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Publico-119.pdf: 1451822 bytes, checksum: feaf2803cde522b94132a62f8fde6def (MD5) / Introdução: A identificação de 42 formas recombinantes circulantes (CRF) de HIV-1, juntamente com suas inúmeras formas recombinantes únicas, evidencia ainda mais o papel da recombinação gênica para esta epidemia. No Brasil, os subtipos B, F e C co-circulam, sendo que cinco CRF entre eles foram recém descobertas. A PCR em tempo real é uma ferramenta rápida, confiável e capaz de detectar diferentes subtipos de HIV-1 e suas formas recombinantes. Objetivo: O objetivo deste trabalho foi desenvolver sistemas de PCR em tempo real capazes de detectar vírus dos subtipos B e F, bem como recombinantes B/F gerados por ensaios de competição in vitro, e, assim, obter uma ferramenta para triagem das CRF brasileiras, 28 e 29, também recombinantes B/F. No futuro, estes sistemas serão testados para discriminação de subtipos de amostras clínicas. Metodologia: Células MT-4 foram infectadas separadamente pelos isolados virais BZ167 (subtipo B) e BR020 (subtipo F), e o sobrenadante foi coletado para otimização dos sistemas de PCR em tempo real (TaqMan®) desenvolvidos para detectar o subtipo de diferentes regiões genômicas, incluindo o gene pol (protease, transcriptase reversa, integrase) e o gene env (gp120 e gp41). Os primers desenhados deveriam amplificar igualmente o subtipo B e F; por outro lado, foram necessárias sondas subtipo-específicas capazes de detectar o subtipo presente no sobrenadante da cultura. As células MT-4 também foram co-infectadas por ambos os isolados, B e F, em iguais condições, para averiguação da possível geração de recombinantes. Para futura validação do uso destes sistemas em amostras clínicas, 157 amostras provenientes do Município de Santos, submetidas à genotipagem, foram seqüenciadas e subtipadas para as cinco regiões genômicas estudadas, utilizando o pacote Philip 3.5, sendo Neighbor-Joining o algoritmo de escolha. Resultados: Os sistemas desenvolvidos apresentaram-se capazes de detectar especificamente os isolados virais. A eficiência estimada para cada sistema, sendo um cálculo para a sonda do subtipo B e outro para F foram de, respectivamente: 80,97 e 85,16% para a região da protease; 89,80 e 75,09% para a região da transcriptase reversa; 80,90 e 83,83% para a região da integrase; 93,49 e 98,93% para a região da gp120; e 88,45 e 80,19% para a região da gp41. Nos ensaios de co-cultivo, a detecção de cada subtipo na primeira e na quinta passagem aconteceu de forma diferente, com variações na média dos valores de Cycle threshold (Ct) de intensidades diferentes. De uma forma geral, a concentração inicial do subtipo B pareceu diminuir, chegando a ficar indetectável em algumas regiões, enquanto do subtipo F pareceu aumentar ao longo das passagens para todas as regiões amplificadas (protease, transcriptase reversa, gp120 e gp41). A exceção foi a região da integrase, para qual foi detectado sinal somente para o subtipo B, sendo este sinal crescente ao longo do tempo. Do seqüenciamento e subtipagem das 157 amostras provenientes da cidade de Santos, foram obtidas seqüências de todas as regiões estudadas para 71 amostras. Destas, 43 foram subtipadas como B em todas as regiões, e somente três como F. De acordo com o padrão de distribuição de subtipos para as regiões, foram encontradas 12 seqüências com o padrão da CRF_28 e 9 no padrão da CRF_29. Nenhum subtipo C foi encontrado em nenhuma das regiões em estudo. Conclusão: O uso da técnica de PCR em tempo real para identificação de subtipos de fragmentos em cultura celular e para avaliação da dinâmica replicativa da recombinação em culturas co-infectadas reforça seu potencial uso em futuros testes in vivo para identificação de estruturas recombinantes. Esta metodologia mostrou ser eficiente, de mais fácil manipulação e mais econômica que o seqüenciamento de DNA. Os ensaios de co-cultivo amplificados pelos sistemas desenvolvidos sugeriram uma distribuição divergente nos subtipos resultantes para as diferentes regiões, sendo um grande indicativo de recombinação. O seqüenciamento das amostras clínicas evidenciou a importância das CRF em estudo, devido sua notável presença na amostragem utilizada, sendo um reflexo da epidemia de um local de grande circulação de mais de um subtipo. / Background: The discovery of 42 HIV-1 circulating recombinant forms (CRF) together with the innumerous unique HIV recombinants forms, makes clear the role of genetic recombination for the epidemic. In Brazil, clades B, F, and C co-circulate, with 5 recently described CRFs. Real Time PCR is a rapid and reliable tool capable of detecting different HIV-1 subtypes and recombinant profiles. Objective: The aim of this study was to develop real time PCR systems in order to detect the Brazilian CRF_28 and CRF_29, which are B/F recombinants, as well as detect B/F recombinants generated by in vitro competition assays. In future, these systems should be able to discriminate subtypes in clinical surveys. Methodology: MT-4 cells were separately infected with the viral strains BZ167 (subtype B) and BR020 (subtype F), and supernatant was collected in order to optimizing the real time PCR systems (TaqMan®) developed to detect the subtype profile of different genomic regions, including pol gene (protease, reverse transcriptase, integrase) and env gene (gp120 and gp41). The designed primers should be able to equally amplify the subtype B and F, which should be discriminated by subtype-specific probes. For future validation of these PCR systems, 157 clinical samples from the city of Santos were sequenced and phylogeneticaly analyzed in order to perform the clade assignment with Neighbor-Joining algorithm (Phylip software package v3.5). Results: The designed systems were able to differentiate the utilized viral strains. The estimated efficiencies for each system, for each probe, subtypes B and F separately, were respectively: 80,97 and 85,16% for protease region; 89,80 and 75,09% for reverse transcriptase region; 80,90% and 83,83% for integrase region; 93,49 and 98,93% for gp120 region; and 88,45 and 80,19% for gp41 region. For the co-infected cell culture, the detection of each subtype was performed in the first and fifth passages. Generally, the initial concentration of subtype B appeared to have decreased, some of them becoming undetectable, whereas subtype F seemed to increase with the passages, for protease, reverse transcriptase, gp120 and gp41 regions. The integrase region was an exception, since only the subtype B was detected, with increasing Cycle threshold (Ct) values over time. Sequencing results revealed that 65 out of 157 samples had the subtype profile defined for all regions. 43 out of 71 were defined as B, whereas 3 were F in all regions. 12 samples presented the CRF_28 profile, and 9 samples presented the CRF_29 profile. There were no subtype C samples in any genomic regions analyzed. Conclusion: The use of real time PCR technique for identification of fragments’ subtypes in cell culture and for evaluation of replicative dynamics of recombination in co-infected cultures warrants its potential use in future in vivo surveys. This methodology proved to be efficient, fast, less cumbersome and less expensive than DNA sequencing. The newly designed systems performed for supernatant of competition assays had suggested a divergent distribution of subtypes for the different regions, which reflects the possibility of genetic recombination. Results from clinical samples revealed a high prevalence of CRF_28/29 in this geographic region, thus reflecting the resulting consequence of different co-circulating strains and pointing to the need for a careful surveillance. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unifesp.br:11600/9894 |
| Date | 28 January 2009 |
| Creators | Teixeira, Daniela [UNIFESP] |
| Contributors | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Diaz, Ricardo Sobhie [UNIFESP] |
| Publisher | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 143 p. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNIFESP, instname:Universidade Federal de São Paulo, instacron:UNIFESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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