Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A leishmaniose visceral representa atualmente um grande problema de saúde
pública. O cão é o principal reservatório doméstico da Leishmania (Leishmania)
infantum, agente etiológico da doença. O diagnóstico correto e seguro da
leishmaniose visceral canina (LVC) é muito importante para evitar a ocorrência
da doença humana e canina, em destaque também o sacrifício desnecessário
de cães. Uma alternativa promissora para o diagnóstico tem sido o uso da
PCR (do inglês Polimerase Chain Reaction). No entanto, um dos maiores
obstáculos para a implementação desta técnica é a falta de padronização e a
determinação da amostra mais adequada. Poucos trabalhos foram realizados
com a finalidade de comparar a sensibilidade dos diversos protocolos e
amostras. O objetivo deste trabalho foi comparar a sensibilidade de cinco
métodos de PCR frente a 4 tipos de amostras clínicas no diagnóstico da
Leishmania infantum em cães com sinais clínicos. Os diferentes métodos de
PCR foram direcionados para alvos distintos do DNA. O kDNA PCR
hibridização, kDNA snPCR e a PCR em tempo real utilizaram iniciadores
endereçados aos minicírculos do DNA do cinetoplasto (kDNA) e os outros dois
métodos apresentam como alvo a região codificante (LnPCR) e intergênica
não codificante (ITS1 nPCR) dos genes do RNA ribossomal (RNAr). As
amostras clínicas de sangue periférico, pele, medula óssea e swab conjuntival
foram avaliadas neste estudo. As amostras de swab conjuntival apresentaram
baixo teor de contaminantes que favoreceu as amplificações, confirmando a
importância deste protocolo de extração, previamente desenvolvido por nosso
grupo de pesquisa. No ITS1 nPCR foi observado 97% de positividade nas
amostras de medula óssea (29/30), seguido pelo swab conjuntival e pele com
83% (25/30) e o sangue periférico com 70% (21/30). Na comparação dos
resultados caninos do LnPCR a medula óssea apresentou maior positividade (90%) 27/30 animais, seguida da pele com 83,3% (25/30), swab conjuntival
73,3% (22/30) e do sangue periférico com 70% (21/30). O desempenho do
kDNA snPCR para as amostras de sangue foi de 50% de positividade (15/30),
seguida da pele com 67% (20/30), 80% (24/30) com a utilização
do swab conjuntival e 83,3% (25/30) com a medula óssea. Das 30 amostras de
sangue periférico, apenas 46,6% foram positivas (14/30) no kDNA PCR
hibridização (utilizando sondas marcadas com 32P), enquanto as amostras de
pele obtiveram 64% de positividade (19/30), seguida pela medula óssea com
83,3% (25/30) e swab conjuntival 96,6% (29/30). A PCR em tempo real revelou
os melhores resultados com 100% de amplificação para as amostras de pele,
medula óssea e swab conjuntival, sendo apenas 3/30 animais nas amostras de
sangue periférico negativos neste método. A quantificação foi realizada em
parasitos por 20 ng/μL de DNA total, quantidade utilizada em todas as reações
de PCR em tempo real. No sangue periférico houve uma variação de 0,003 a
0,55 parasitos, nas amostras de pele foram encontrados de 0,004 a 89,74, na
medula óssea a variação foi de 0,001 a 118 e no swab conjuntival de 0,0002 a
22,91. Este estudo apontou a PCR em tempo real associada
ao swab conjuntival como a melhor opção no diagnóstico molecular da LV em
cães apresentando sinais clínicos da infecção. / Visceral leishmaniasis is currently a majorpublic health problem. Dogs are the
main domestic reservoir of Leishmania (Leishmania) infantum, the etiological
agent of the disease. The correct and safe diagnosis of the canine visceral
leishmaniasis (CVL) is very important to prevent the occurrence of the human
and canine disease, also highlighted the unnecessary culling of dogs. A
promising alternative for diagnosis has been the use of PCR (Polymerase Chain
Reaction). However, a major obstacle to the implementation of this technique is
the lack of standardization and the selection of the most appropriate sample.
Few studies have been performed comparing the sensitivity of different
protocols and samples. The objective of this study was to compare the
sensitivity of five PCR methods against 4 types of clinical samples for the
diagnosis of Leishmania infantum in dogs with clinical signs. The different PCR
methods used primers addressed to distinct DNA targets. The kDNA PCR
hybridization, kDNA snPCR and real time PCR used primers addressed to
minicircle of the DNAs kinetoplast (kDNA) and the other two methods for the
coding (LnPCR) and non-coding intergenic spacer regions (ITS1nPCR) from
ribosomal RNA genes (rRNA). Clinical samples of peripheral blood, skin, bone
marrow and conjunctival swabs were evaluated in this study. Conjunctival swab
samples showed low levels of contaminants that allowed high-quality
amplifications, confirming the value of the extraction protocol previously
developed by our research group. The ITS1 nPCR showed 97% of positivity in
bone marrow samples (29/30) followed by conjunctival swab and skin with 83%
(25/30) and the peripheral blood with 70% (21/30). In the comparison of the
canine results of LnPCR the bone marrow showed 90% (27/30) of positivity,
followed by skin with 83.3% (25/30), conjunctival swab 73.3% (22/30) and
peripheral blood 70% (21/30). The kDNA snPCR presented 50% (15/30) of positivity for blood samples, 67%
(20/30) for skin, 80% (24/30) using the conjunctival swab and 83,3% (25/30) for
bone marrow. The kDNA hybridization PCR (using 32P labeled probes) allowed
46.6% (14/30) of positivity for peripheral blood, 64% (19/30) for skin biopsies,
83.3% (25/30) for marrow bone and 96.6% (29/30) by conjunctival swabs. The
real time PCR revealed the best results with 100% amplification for skin
biopsies, bone marrow and conjunctival swab samples, and only 3/30 animals
for peripheral blood samples were negative by this method. Quantitative results
were expressed as number of parasites per 20 ng of DNA, amount used in all
real time PCR reactions. A range from 0.003 to 0.55 parasites were found in
peripheral blood samples, 0.004 to 89.74 in the skin biopsies, 0.001 to 118 in
bone marrow and 0.0002 to 22,91 parasites in conjunctival swabs. This study
pointed the real time PCR combined with conjunctival swab as the best option
in the molecular diagnosis of VL in dogs with clinical signs of infection.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:bdtd.cdtn.br:193 |
| Date | 01 March 2013 |
| Creators | Aline Leandra Carvalho Ferreira |
| Contributors | Antero Silva Ribeiro de Andrade, Célia Maria Ferreira Gontijo, Cristiane Rodrigues Corrêa |
| Publisher | CNEN - Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear, Belo Horizonte, CTRA - Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais, CDTN, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações do CDTN, instname:Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear, instacron:CDTN |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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