Der Tumorsupressor APC ist in der Mehrzahl aller Fälle kolorektaler Karzinome bereits in
der initialen Phase der Karzinogenese mutiert. Diese Mutationen führen zu einer aberranten Aktivierung des Wnt-Signalweges sowie zu weiteren die Karzinogenese vorrantreibenden Aktivitäten, beispielsweise einem veränderten Migrationsverhalten. Dieser Dissertation
zu Grunde liegt die Idee, dass durch die Trunkierung des APC-Proteins aber auch Abhängigkeiten von Genaktivitäten entstehen, die zuvor entbehrlich waren. Solche synthetisch
letalen Gene sollten in einem high-content shRNA-Screen gefunden werden.
Für die Durchführung des Screens wurde ein von der SW480 Kolonkarzinomzelllinie
abgeleitetes, isogenes Zellsystem generiert, welches durch Induktion mit Doxyzyklin das
vollständige APC-Allel (FL-APC) exprimiert. Infolge dieser Expression zeigen die Zellen
einen weniger malignen Phänotyp. Dies spiegelt sich darin wider, dass die Zellen durch
FL-APC Expression in ihrer Wnt-Signalwegsaktivität eingeschränkt werden. Doxyzyklininduzierte Zellen sind schlechter in der Lage ohne Adhäsion zu proliferieren als nicht induzierte Zellen. Andererseits ist ihre Fähigkeit einem FKS-gradienten entlang zu migrieren
verbessert.
Der shRNA-Screen wurde mit der Decipher shRNA-Bibliothek durchgeführt. Diese
enthält 27.500 verschiedene shRNAs mit Interferenzaktivität gegen 5.000 mRNAs, die potentiell pharmakologisch inhibierbare Proteine kodieren. Die besten zwei Kandidaten für
eine synthetisch letale Interaktion mit trunkiertem APC, BCL2L1 und EIF2B5 wurden im
Verlauf einer Masterarbeit bzw. direkt in dieser Disseration validiert. EIF2B5 zeigte in vitro nach Depletion durch unterschiedliche shRNAs einen di erentiellen Proliferationse ekt
bei FL-APC induzierten im Vergleich zu kontrollbehandelten Zellen. Dieser di erentielle
E ekt konnte in einem weiteren Modellsystem, SW480 Zellen mit konstitutiver FL-APC
Expression, ebenfalls validiert werden.
Durch Expression einer shRNA mit Aktivität gegen EIF2B5 werden in beiden Zellsystem die unfolded protein response (UPR) Gene DDIT3 und splXBP1 aktiviert. Interessanterweise werden durch die Expression von FL-APC diese Gene reprimiert. Im Promotor
der EIF2B5-mRNA be ndet sich eine Bindestelle für MYC. Es ist denkbar, dass durch die
Expression von FL-APC eine globale Veränderung der Genexpression vorgenommen wird,
die einerseits eine Repression von EIF2B5 nach sich zieht aber andererseits eine hierdurch
ausgelöste ER-Stress Antwort verhindert. Eine Inhibition von EIF2B5 ohne diese Adaption
andererseits führt nach diesem Model zu einer UPR-aktivierten Apoptose.
In einem zweiten Projekt wurde das überraschende Verhalten von Kolonkarzinomzellen untersucht, die nach Zugabe von BEZ235, einem dualen PI3K/mTOR Inhibitor, trotz
gegenteiliger Erwartungen MYC-Proteinmengen erhöhen. Eine Repression wurde erwar-
tet, weil die Inhibition von PI3K einerseits zu einer proteasomalen Destabiliserung und
andererseits die mTOR Inhibition zu einer verringerten Synthese von MYC führen sollte.
Während bereits gezeigt werden konnte, dass durch einen FOXO-vermittelten Mechanismus MAPK-abhängig die MYC-Expression verstärkt wird, wurde in dieser Dissertation
die erwartete Translationsinhibition untersucht. BEZ235 inhibiert zwar CAP-abhängige
Translation, das MYC Protein wird jedoch aufgrund einer IRES-vermittelten Translation
weiterhin exprimiert. Silvestrol, ein Inhibitor der Helikase eIF4A andererseits interveniert
mit CAP- und IRES-abhängiger Translation und kann die MYC-Proteinkonzentrationen
verringern. Wir konnten zudem feststellen, dass die Applikation von Silvestrol auch in vivo
möglich und wirksam ist und zudem tolleriert wird. Dies gibt Anlass zur Ho nung, dass
eine Intervention der Translation auch im Menschen eine valide Strategie zur Behandlung
MYC-getriebener Tumore sein könnte. / The tumorsupressor APC is mutated in initiating colorectal cancers. These mutations
lead to an aberrant actiavation of the wnt-signaling pahtway and to further carcinogenic
activities such as altered migration behaviour. The idea that novel dependencies upon
previously expendable genes are generated through APC-mutations form the basis of this
disseration. These so called synthetic lethal Genes were searched for harnessing a high
content shRNA screen.
We generated an isogenic cell system which was deviated from the colorectal cancer cell
line SW480. These cells naturally express truncated APC. The generated system expresses a
full-lenght allele upon doxycycline exposure. SW480 cells which are induced partially revert
their malignancy. Ancorage independend growth is compromised and migration along a
gradient of fetal calf serum is improved.
The Decipher shRNA library was used for screening. It consists of 27.500 di erent
shRNAs intefering with the activity of 5.000 genes which are potantially drugable. The
two best candidates scoring as hits in the screen were EIF2B5 and BCL2L1. BCL2L1 was
validated in a cooperating masterthesis and EIF2B5 could be validated in the course of
this diseration. Following EIF2B5 depletion using di erent shRNA constructs, we were
able to see di erential behaviour in pTRE-APC cells as well as in a second model system
in which FL-APC was expressed constitutively.
Interestingly an activation of the ER-Stress genes DDIT3 and splXBP1 can be seen after EIF2B5 depletion. These genes are repressed, when FL-APC ist expressed. The EIF2B5
promotor has a MYC-binding site and we speculate, that FL-APC expression induces a
genetic program which represses EIF2B5 on the one hand, however prohibits the ER-Stress
reaction which follows this trigger. Inhibtion of EIF2B5 without this global adaption in
genexpression on the other side initiates UPR-mediated apoptosis.
In a second project, the suprising behaviour of colon carcinoma cell lines, which upregulate MYC upon BEZ235 exposure was examined. The dual inhibitor was thought to
downregulate MYC through its PI3K and mTOR inhibitory acitivites which were thought
to destabilise and MYC and prohibit it's expression, respectively. Whereas former work
could demonstrate a FOXO-mediated, MAPK-dependend positive MYC-gene expression
clue the aim of this thesis was to analyse the expecte protein tranlational inhibition. Indeed,
BEZ235 inhibits CAP-dependend translation, however the MYC protein is still translated
through IRES-dependend translation. The eIF4A-inhibitor Silvestrol intervenes with both
CAP- and IRES-dependend translation and can therefore reduce MYC protein levels
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:16645 |
| Date | January 2018 |
| Creators | Uthe, Friedrich Wilhelm |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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