O gene SLC45A2 codifica a proteína MATP, envolvida na síntese de melanina através do processamento e transporte intracelular da tirosinase e transporte de prótons para o melanossomo. Por sua vez, a tirosinase, codificada pelo gene TYR, catalisa os dois primeiros passos da conversão de tirosina em melanina, além de atuar em uma etapa final da biossíntese de eumelanina. Considerando que polimorfismos nestes genes influenciam a variação de características normais de pigmentação, que somente recentemente mais informações sobre a função do gene SLC45A2 foram descobertas e que diversas questões sobre o envolvimento da tirosinase nos fenótipos normais de pigmentação ainda permanecem sem total compreensão, é necessário o melhor entendimento das interações entre as variantes desses genes de pigmentação e moléculas regulatórias, assim como o conhecimento sobre a diversidade de tais genes em uma população miscigenada como a brasileira. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo analisar a diversidade genética das regiões, promotora, codificante e 3\'UTR dos genes SLC45A2 e TYR em uma amostra da população brasileira. As regiões regulatórias e codificadoras dos genes SLC45A2 e TYR foram analisadas por sequenciamento de nova geração em uma amostra de 340 indivíduos, estratificados de acordo com a pigmentação dos olhos, cabelos e pele, bem como quanto à presença ou ausência de sardas. Bibliotecas de DNA foram preparadas utilizando o Haloplex Target Enrichment System (Agilent Technologies) e sequenciadas por meio da plataforma MiSeq (Illumina). Os softwares cutadapt, BWA e GATK/VCFx foram utilizados para trimagem dos adaptadores, alinhamento e chamada de variantes, respectivamente. O programa PHASE foi utilizado para a reconstrução dos haplótipos. Um total de 58 variantes foram identificadas no gene SLC45A2. Destas, 28 foram associadas a pelo menos uma das características de pigmentação avaliadas. Embora as regiões nãocodificadoras tenham apresentado maior diversidade genética, associações significativas também foram encontradas em regiões exônicas. Dentre estas, destaca-se a associação do alelo rs16891982*G (exon 5, Leu374Phe) com pele clara (p = 9,54 x 10-35, OR = 22,66) e cabelos loiros (p = 1,59 x 10-26, OR = 31,72). Quando observamos os haplótipos inferidos para as regiões codificantes das isoformas 1 e 2 que possuem esse SNP e as associações encontradas, podemos notar que os únicos haplótipos associados com fenótipos de pigmentação claros para ambas isoformas [\"Iso2cds1\": pele clara (p = 3,65 x 10-29, OR =22,63) e cabelos loiros (p = 6,34 x 10-23, OR = 26,19); \"Iso1cds1\": pele clara (p = 1,08 x 10-24, OR = 17,38) e cabelos loiros (p = 1,94 x 10-22, OR = 22,93)] possuem como diferença em relação a todos os outros haplótipos associados com pigmentação escura o alelo rs16891982*G. Para o gene TYR foram identificadas 42 variantes e 15 se mostraram associadas a algum dos fenótipos de pigmentação avaliados. A maior parte da diversidade desse gene foi encontrada na região intrônica, com ênfase para a associação do genótipo rs1393350*A/A com olhos azuis (p = 0,0253, OR = 13,06) e cabelos castanho-claros (p = 0,0019, OR = 16,07). Ao analisarmos as associações encontradas para os haplótipos inferidos para essa região, podemos notar que os haplótipos \"cds5\" (p = 1,71 x 10-05, OR = 21,26), \"cds7\" (p = 0,0061, OR = 23,70) e \"cds9\" (p = 0,0017, OR = 29,25) estão associados a pele escura e o haplótipo \"cds12\" (p = 0,015, OR = 21,61) a ausência de sardas. Quando nos atentamos a composição desses haplótipos em relação ao SNP rs1393350, podemos perceber que todos os haplótipos possuem o alelo referência (rs1393350*G), o que é consistente com a associação entre o genótipo (rs1393350*A/A) e fenótipos de pigmentação claros. Os resultados aqui encontrados reafirmam a importância desempenhada pelos genes SLC45A2 e TYR na geração da diversidade de fenótipos de pigmentação. / The SLC45A2 gene encodes the Membrane-Associated Transporter Protein, which mediates melanin synthesis by tyrosinase trafficking and proton transportation to melanosomes. On the other hand, the tyrosinase protein, encoded by the TYR gene, catalyzes the first two steps of tyrosine to melanin conversion in addition to acting in a final stage of eumelanin biosynthesis. Considering that polymorphisms in these genes influence normal pigmentation variation, that only recently more information about SLC45A2 gene function were discovered and that many questions about the tyrosinase involvement in normal pigmentation phenotypes are still not fully understood, it is necessary to better understand the interactions between variants in these pigmentation genes and regulatory molecules, as well as to improve knowledge about their diversity in a mixed population like the Brazilian one. Thus, the present study aimed at analyzing the genetic diversity of the promoter, coding and 3\'UTR regions from the SLC45A2 and TYR genes in a Brazilian admixed population sample (n=340). The regulatory and coding regions were analyzed by next-generation sequencing procedures. The individuals were stratified according to eye, hair and skin pigmentation, as well as to the presence or absence of freckles. DNA libraries were prepared using the Haloplex Target Enrichment System (Agilent Technologies) and sequenced at the MiSeq platform (Illumina). cutadapt, BWA and GATK/VCFx software packages were used for trimming adaptor sequences, alignment and genotype calling, respectively. The PHASE program was used for haplotypes reconstruction. A total of 58 variation sites were identified in the SLC45A2 gene. Of these, 28 were found in association with at least one of the analyzed pigmentation characteristics. Although the non-coding regions were more diverse, the exonic region also showed significant associations. Among them, the association of the rs16891982*G allele (exon 5, Leu374Phe) with light skin (p = 9.54 x 10-35, OR = 22.66) and blond hair (p = 1.59 x 10-26, OR = 31.72) stands out. When we observe the inferred haplotypes for the isoforms 1 and 2 coding regions that have this SNP and the associations found, we can recognize that haplotypes associated with light pigmentation phenotypes [\"Iso2cds1\": light skin (p = 3.65 x 10-29, OR = 22.63) and blond hair (p = 6.34 x 10-23, OR = 26.19); \"Iso1cds1\": light skin (p = 1.08 x 10-24, OR = 17.38) and blond hair (p = 1.94 x 10-22, OR = 22.93)] have the rs16891982*G allele, while haplotypes associated with dark pigmentation harbors the other one. Forty-two variation sites wereidentified for the TYR gene and 15 of them were associated with one of the evaluated pigmentation phenotypes. Most of the diversity of this gene was found in the intronic region, with emphasis on the association of genotype rs1393350*A/A with blue eyes (p = 0.0253, OR = 13.06) and light brown hair (p = 0.0019, OR = 16.07). When we analyze the associations found for the inferred haplotypes for this region, we can note that the haplotypes \"cds5\" (p = 1.71 x 10-05, OR = 21.25), \"cds7\" (p = 0.0061, OR = 23.70) and \"cds9\" (p = 0.0017, OR = 29.25) were associated with dark skin and the haplotype \"cds12\" (p = 0.015, OR = 21.61) with absence of freckles. When the composition of the haplotypes concerning this SNP (rs1393350) is taken into account, we can see that all haplotypes have the reference allele (rs1393350*G), which is consistent with the association between the rs1393350*A/A genotype and lighter pigmentation phenotypes. These findings provide additional support to the role played by SLC45A2 and TYR in the generation of pigmentation phenotypes diversity
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-08042019-164618 |
| Date | 16 June 2014 |
| Creators | Fracasso, Nádia Carolina de Aguiar |
| Contributors | Mendes Junior, Celso Teixeira |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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