A proteína quinase dependente de RNA (PKR) é uma molécula sentinela ativada em situações de estresse celular, incluindo infecções virais. A ativação de PKR por meio de sua fosforilação aciona cascatas de sinalização intracelular envolvidas em respostas inflamatórias e inibição da síntese protéica. Dados prévios do nosso laboratório sugerem que PKR está envolvida na hiperalgesia térmica de origem inflamatória. No presente estudo, foi investigado o papel da PKR na hiperalgesia térmica induzida pelo vírus da herpes simples tipo 1 (HSV1), durante as fases herpética e pós-herpética, combinando métodos comportamentais, genéticos, farmacológicos e moleculares. Camundongos C57bl/6, PKR+/+ e PKR-/- machos foram inoculados com HSV1. Os grupos controle foram inoculados com HSV1 inativo. Alodínia mecânica e hiperalgesia térmica foram monitoradas antes da inoculação do vírus e 8, 14, 21 e 28 dias após a inoculação. A curva dose e temporesposta e o teste da capsaicina foram realizados no 8º e 21º dias após a inoculação do vírus. Também nos períodos herpético e pós-herpético, foi investigado o perfil de expressão de proteínas envolvidas nas vias de sinalização de PKR (PKR, eIF2?, PACT, IKK e PP2A?), assim como o efeito da inibição de PKR pelo monitoramento da fosforilação de PKR, IKK?/?, P38, JNK, ERK1,2 e STAT3, e expressão de CaMKII? e TRPV1 nos GRD (L3-L6) ipsilateralmente à pata inoculada. Alodínia mecânica e hiperalgesia térmica ficaram evidentes até 28 dias após a inoculação. Camundongos PKR-/- desenvolveram alodínia mecânica, mas não hiperalgesia térmica, quando comparados com animais PKR+/+. A inibição sistêmica de PKR reverteu a hiperalgesia térmica de modo tempo- e dose-dependente e preveniu o comportamento nocifensivo induzido por capsaicina, enquanto PKR-/- apresentaram resposta nocifensiva praticamente ausente em ambas as fases herpética e pósherpética. Houve aumento da expressão de PP2A? e da fosforilação de PKR, IKK?/? e eIF2?, durante os períodos herpético e pós-herpético, e de PACT na fase pósherpética. A inibição de PKR promoveu o aumento da fosforilação de P38 em ambas as fases, e redução da fosforilação de PLC?1 acompanhada do retorno da fosforilação de Akt e STAT3 ao nível do grupo controle e o aumento da expressão de Ca-MKII? na fase herpética. Já na fase pós-herpética, reduziu a fosforilação de JNK e Akt e a expressão de Ca-MKII?, retornou a fosforilação de ERK1,2, PLC?1 e STAT3 ao nível do grupo controle e aumentou a expressão de TRPV1. Nossos resultados indicam que a atividade de PKR desempenha papel essencial na hiperalgesia térmica induzida por infecção pelo HSV1 / Double stranded RNA-activated protein kinase (PKR) is a sentinel molecule activated by cellular stress conditions, including viral infections. PKR activation by phosphorylation triggers cascades involved in inflammatory response and protein synthesis suppression. Our previous data suggest that PKR is involved in the inflammatory thermal hyperalgesia. Here we investigated the role played by PKR on thermal hyperalgesia induced by herpes simplex virus type-1 (HSV-1), during herpetic and post-herpetic phases, by combining behavioral, genetic, pharmacological, and molecular methods. Adult male C57bl/6, PKR+/+ and PKR-/- mice were inoculated with HSV-1. Control groups were inoculated with inactive (mock) HSV1. Mechanical allodynia and thermal hyperalgesia were monitored before virus inoculation and 8, 14, 21, and 28 days post-inoculation. The dose- and timeresponse curve and the capsaicin test were performed at 8th and 21st days post virus inoculation. Also in the herpetic and post-herpetic periods, was investigated the expression profile of proteins involved in the PKR signaling pathways (PKR, eIF2?, PACT, IKK and PP2A?), and the effect of PKR inhibition by monitoring PKR, IKK?/?, P38, JNK, ERK1,2, and STAT3 phosphorylation, and Ca-MKII? and TRPV1 expression in the dorsal root ganglia (L3-L6) ipsilaterally to the inoculated paw. Mechanical allodynia and thermal hyperalgesia became evident until 28 days postinnoculation. PKR-/- mice developed mechanical allodynia but not thermal hyperalgesia, when compared with PKR+/+ mice. Systemic PKR inhibition reversed thermal hyperalgesia in a dose and time-dependent manner, and prevented the capsaicin-induced nocifensive behavior, whereas PKR-/- showed no nocifensive behavior almost absent in both herpetic and post-herpetic phases. There was increased expression of PP2A? and the phosphorylation of PKR, IKK?/?, and eIF2?, during herpetic and post-herpetic periods, and PACT in the post-herpetic phase. PKR inhibition increased P38 phosphorylation in both phases, and reduction of PLC?1 phosphorylation together with the return of the Akt and STAT3 phosphorylation to the control group level, and enhanced Ca-MKII? expression in the herpetic phase. At the post-herpetic phase, suppressed JNK and Akt, and Ca-MKII? expression returned ERK1,2, PLC?1 and STAT3 phosphorylation to control group level and increased TRPV1 expression. The data indicate that PKR activity plays an essential role in the HSV-1 infection-induced thermal hyperalgesia
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-21072016-143055 |
| Date | 25 February 2016 |
| Creators | Mota, Clarissa Maria Dias |
| Contributors | Lucas, Guilherme de Araujo |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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