Pseudomonas aeruginosa PA14 est une bactérie pathogène très résistante aux antibiotiques et impliquée dans de nombreuses infections nosocomiales. Toutefois, la disponibilité d'agents antibactériens efficaces contre cette bactérie manque cruellement à ce jour. Explorer la physiologie de P. aeruginosa au niveau des modifications post-traductionnelles (PTMs) pourrait fortement contribuer au développement de nouveaux agents thérapeutiques. En effet, il a été montré certaines corrélations entre les PTMs et la virulence, l’adaptation et la résistance bactérienne. De plus, les progrès récents en protéomique ont permis d’accéder à un nombre croissant des protéines modifiées. Pourtant, leur description reste un véritable challenge.Dans une première partie, nous avons étudié l'impact des kinases et des phosphatases sur la physiologie de P. aeruginosa PA14. Cependant, aucune différence de phénotype n'a été observée entre les 8 mutants de ces enzymes et la souche sauvage.Dans une deuxième partie, nous avons caractérisé le succinylome et l'acétylome de la lysine chez P. aeruginosa PA14 dans quatre sources de carbone (glucose, citrate, succinate et glutamate) par enrichissement par anticorps couplé à la spectrométrie de masse. Ainsi, 1 530 sites succinylés (617 protéines) et 1 109 sites acétylés (526 protéines) ont été identifiés. De façon intéressante, 622 sites (312 protéines) ont été observés acétylés ou succinylés sur la même lysine, révélant ainsi l'existence de protéoformes pour une même protéine. Les protéines modifiées sont impliquées dans tous les processus biologiques. Toutefois, certaines d'entre elles ont des fonctions dans la résistance aux antibiotiques, le chimiotactisme et la virulence.Nous avons également quantifié les peptides succinylés et/ou acétylés dans les 4 sources de carbone. Les peptides succinylés étaient principalement sur-exprimés en citrate, mais aucune différence significative n’a été observée pour les peptides acétylées.Dans une troisième partie, nous avons étudié par immunoprécipitation le succinylome et l’acétylome de la lysine des protéines extracellulaire de P. aeruginosa. Nous avons montré que certaines lysines des protéines LasB et CbpD, deux facteurs de virulence, sont modifiées par 9 PTMs différentes. Une approche d’électrophorèse bi-dimensionnelle (2D) a permis de révéler et de quantifier les protéoformes des protéines extracellulaires et plus spécifiquement de ces facteurs de virulence.Dans une quatrième partie, une approche quantitative « label-free » a permis de mettre en avant 581 protéines qui varient différemment selon la source de carbone. Parmi ces protéines, 67 biomarqueurs ont été identifiés par approche statistique.Ces travaux constituent un point de départ prometteur pour de futures études sur le rôle de la succinylation de la lysine et d'autres PTMs chez P. aeruginosa. / Pseudomonas aeruginosa PA14 is a multi-drug resistant human pathogen largely involved in nosocomial infections. Unfortunately, today, effective antibacterial agents lacked. Explore its physiology at the post-translational modification (PTMs) level may contribute to the renewal of combat tactics. Indeed, some correlations between PTMs and the bacterial virulence, adaptation and resistance have been shown. The recent improvements in proteomics have increased the number of modified proteins. However, their characterization believes a real challenge.In the first part, we focused on the impact of kinases and phosphatases on bacterial physiology of P. aeruginosa PA14. For this purpose, we compared different phenotypes of 8 mutants of kinase and phosphatase with the WT strain. Unfortunately, no difference was observed.In the second part, we characterized the lysine succinylome and acetylome in P. aeruginosa PA14 in 4 carbon sources (glucose, citrate, succinate and glutamate) by mass spectrometry. Overall, a total of 1 530 succinylated sites (617 proteins) and 1 109 acetylated sites (526 proteins) were identified. Interestingly, we noticed that 622 sites (312 proteins) can be either acetylated or succinylated on the same lysine. This reveals the existence of proteoforms for a same protein. As expected, many modified proteins are involved in a wide range of biological processes but some of these proteins have interesting functions like antibiotic resistance, chemotaxis and virulence.We also tried to quantify succinylated and/or acetylated peptides in the 4 carbon sources. Succinylated peptides were mainly over-represented in the citrate condition whereas no significant difference was observed for the acetylated forms.In the third part, we investigated the lysine succinylome and acetylome of P. aeruginosa in extracellular compartment by immunoprecipitation. We showed that some lysines of two virulence factors, LasB and CbpD, were modified by 9 different PTMs. We also used a 2-dimensional gel approach to reveal and quantify proteoforms of extracellular proteins and more specifically virulence factors. In the fourth part, we did a label-free quantitative approach to obtain protein abundance in each carbon source. In total, 581 proteins vary differently depending on the carbon source. Among these proteins, 67 biomarkers were identified by statistical approach.This work is a promising starting point for further investigations on the biological role of lysine succinylation, and others PTMs, in P. aeruginosa.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2018NORMR094 |
| Date | 18 December 2018 |
| Creators | Gaviard, Charlotte |
| Contributors | Normandie, Hardouin, Julie |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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