La photosynthèse est un processus permettant la conversion de l'énergie lumineuse en énergie organique dans les chloroplastes des embryophytes. Les complexes photosynthétiques sont d'une origine génétique double. Leurs sous-unités sont codées à la fois par le génome nucléaire et par le génome chloroplastique. Parmi les protéines codées par le génome nucléaire et adressées au chloroplaste, se trouvent de nombreux facteurs impliqués dans les différentes étapes de la maturation des transcrits des gènes chloroplastiques (clivage, épissage, édition, stabilisation et traduction). En particulier, les protéines à motifs pentatricopeptide repeat (PPR) sont impliquées dans toutes ces étapes, notamment l'édition, via leur capacité à lier des séquences spécifiques d'ARN par leurs domaines PPR. L'édition des ARN des organites est réalisée par un complexe protéique nommé l'éditosome. Au sein de ce complexe, les protéines PPR sont les facteurs de spécificité mais également très probablement les enzymes catalysant la réaction grâce à leur domaine DYW. De nombreux facteurs d'édition composant ce complexe ont été découverts et caractérisés. Toutefois, de nombreuses questions portant sur le rôle de l'édition et le fonctionnement de l'éditosome restent encore ouvertes. Au cours de cette thèse, j'ai cherché à répondre à trois questions.En premier lieu, j'ai cherché à identifier de nouveaux facteurs associés à l'éditosome par des approches indépendantes de celles déjà utilisées. En effet, la découverte de nouveaux facteurs pourrait permettre l'identification de régulateurs de l'édition, ouvrant la voie à une meilleure compréhension à la fois du fonctionnement moléculaire de l'édition mais aussi de sa fonction biologique. Une approche par purification de complexes (réalisée avant la thèse) et un crible double hybride chez la levure ont été entrepris. La première approche a permis d'identifier de nouvelles protéines PPR associées à l'éditosome. La seconde approche a permis d'identifier la protéine CBSX2 dont l'interaction avec un membre de l'éditosome n'a pas semblé spécifique. Toutefois, elle a conduit à la caractérisation fonctionnelle de CBSX2 en tant que régulateur potentiel de l'activité des thiorédoxines. Mes résultats ont montré qu'in vitro CBSX2 inhibe spécifiquement l'activité réductrice d'un sous-groupe de thiorédoxines. Cette inhibition implique des interactions entre protéines et est levée par la liaison d'AMP à CBSX2.J'ai également cherché à savoir si le domaine DYW des PPR est indispensable dans l'éditosome. En effet, selon l'hypothèse la plus couramment admise, le domaine DYW serait l'enzyme de la réaction d'édition, il serait donc nécessaire dans le complexe. Néanmoins, la caractérisation de protéines PPR ne possèdent pas de domaine DYW mais requises pour l'édition remet en question cette hypothèse. Pour cela, la complémentation de mutants d'édition avec une combinaison de formes tronquées de protéines PPR a été entreprise et est toujours en cours. Elle devrait permettre prochainement de valider (ou non) un modèle selon lequel le domaine DYW est nécessaire et apporté en trans aux protéines PPR par une petite sous-famille de protéines PPR-DYW particulières.Enfin, j'ai cherché à savoir si la différenciation des chloroplastes s'accompagnait d'une édition différentielle de certains ARN. En particulier, le cas de la différenciation des chloroplastes des plantes « en C4 » a été étudié. Dans ce cas, une régulation de l'expression des gènes des organites pourrait être impliquée dans la mise en place de la différenciation chloroplastique. Dans ce contexte, l'édition pourrait jouer un rôle dans la régulation de la maturation des transcrits. L'analyse comparative des données produites a nécessité le développement d'un pipeline d'analyse bio-informatique spécifique. Cette étude a permis de montrer une expression différentielle des gènes chloroplastiques sans modification de l'édition et de l'épissage. / Photosynthesis is a process that converts light energy into organic energy in the chloroplasts of embryophytes. This process requires a protein apparatus encoded by both the nuclear and the plastidial genomes of the plant cells. Among the nuclear encoded proteins addressed to the chloroplast are many factors involved in the different maturation steps of chloroplast transcripts (cleavage, splicing, editing, stabilization and translation). In particular, pentatricopeptide repeat proteins (PPR) are involved in all these steps, including editing, through their sequence specific RNA binding PPR motifs. Organellar RNA editing is performed by a protein complex called the editosome. Within this complex, a PPR protein is the specificity factor and probably also the editing enzyme through its DYW domain. Many other editing factors within this complex have been discovered and characterized. However, many questions concerning the function of editing and the functioning of editosome are remaining. During my PhD thesis, I tried to answer three of these questions.First, I investigated whether new editosome proteins could be identified using new independent approaches. Indeed, the discovery of new factors could allow the identification of editing regulators, paving the way for a better understanding of the molecular editing mechanism and its biological function. Protein complex purification (realized before my PhD) and a yeast two hybrid screening were performed. The first approach only identified PPR proteins, while the second did not yield any specific interaction. However, the search for editosome components allowed the identification and characterization of CBSX2, a potential regulator of thioredoxin activity. CBSX2 was shown to specifically inhibit the in vitro reductase activity of some thioredoxins. This inhibition is mediated by protein-protein interaction and reverted by CBSX2 AMP binding.I also investigated the requirement of the DYW domain for editing. According to the main stream hypothesis, DYW domains (of PPR proteins) carry the editing activity. Consequently, they must be an essential component of the editosome. However, the characterization of PPR proteins that do not carry a DYW domain but are required for editing challenges this hypothesis. To test the DYW requirement for editing, complementations of editing mutants with several truncated PPR proteins have been performed. So far, these experiments should allow us to validate (or not) a model in which the DYW domain is necessary and provided in trans to PPR proteins by a small sub-family of particular PPR-DYW proteins.Finally, I investigated whether plastid differentiation was linked to differential editing of some transcripts. In particular, C4 photosynthetic plastid differentiation served as a model. In particular, regulations that drive C4 differentiation could rely on organellar gene expression. In this context, editing could participate to differential transcript maturation. Data analysis of C4 plastid transcriptomes required the development of a specific bioinformatic analysis pipeline. This study revealed differentially expressed plastidial genes without editing and splicing modification.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2019SACLE036 |
| Date | 17 December 2019 |
| Creators | Baudry, Kévin |
| Contributors | Paris Saclay, Lurin, Claire, Majeran, Wojciech |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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