En aquest treball s’ha optimitzat el procés de producció de lipases de Rhizopus
oryzae amb el fenotip Muts de Pichia pastoris mitjançant la utilització de substrats
mixtes establint les condicions de procés més favorables.
S’utilitza un sistema de 48 milibioreactors de 12 ml de volum amb l’objectiu
d’optimitzar el procés de selecció de l’estratègia de cultiu més efectiva. Quan els cultius
es realitzen utilitzant els fenotips Muts i Mut+ de P. pastoris sota promotors induïbles
(AOX i FLD) s’obté un creixement deficient. La principal problemàtica recau en el
sistema de condensació que presenten els milibioreactors a la part superior. S’utilitza el
promotor GAP utilitzant glicerol i glucosa com a substrats, amb el que es demostra la
viabilitat del sistema de 48 milibioreactors pel seguiment de bioprocessos.
Posteriorment davant les avantatges que presenta la utilització de substrats mixtes en
soques de fenotip Muts sota el promotor AOX, s’utilitzen sorbitol o glicerol juntament
amb el metanol per observar l’efecte del cosubstrat sobre la producció de ROL. A
l’utilitzar el sorbitol es realitzen cultius en semicontinu mantenint la concentració de
metanol fixada en 0.5, 2 i 4 g l-1 i es manté la μ fixada en 0.01 i 0.02 h-1. S’observa que
la concentració de metanol residual en el medi de cultiu és el paràmetre clau per
l’optimització de la producció de ROL, trobant-se els valors màxims quan aquesta es
troba fixada a 2 g l-1. A l’augmentar o bé disminuir aquesta concentració, la
productivitat disminueix considerablement (2 vegades). Finalment es valida un sistema
SIA per a l’anàlisi de sorbitol en línia.
El sorbitol es considera un cosubstrat excel·lent però presenta una baixa μmax, fent
així que el procés de producció sigui menys efectiu, si es compara amb una font de
carboni alternativa. S’utilitza el glicerol com a cosubstrat, el que permetrà treballar a μ
5 vegades superiors. Es realitzen cultius en semicontinu mantenint la concentració de
metanol fixada en 2 g l-1 (valor optimitzat prèviament). En aquest treball es realitzen
diferents cultius on la μ es manté fixada en 0.1, 0.05 i 0.02 h-1. Es conclou que per evitar
la repressió del promotor AOX la relació establerta entre les μ ha de ser inferior a 6 (μGli
μMet-1), degut que al superar aquest valor s’observa una clara repressió del promotor
AOX.
A continuació, es decideix realitzar el canvi d’escala de les condicions més
productives. Es realitzen varis cultius utilitzant el reactor a un volum inicial de treball
de 30 l. Després d’estimar un favorable canvi d’escala es reprodueixen les condicions
obtingudes en el millor dels processos. Durant aquest primer cultiu s’obtenen valors de
productivitat volumètrica i específica 2.8 vegades inferiors als obtinguts prèviament en
5 l. Es realitzen experiments per comprovar la mescla del metanol al reactor UD50
mostrant un gradient màxim de 0.5 gMet l-1 a les diferents alçades. Es realitza una
modificació al sistema d’addició del metanol, addicionant-lo de forma submergida a mitja alçada del reactor. Posteriorment els resultats milloren en un 48%, en comparació a l’addició pel capçal del reactor.
Finalment es treballa amb una construcció genètica del fenotip Muts de P. pastoris
que inclou la coexpressió del gen HAC1. Es treballa amb 2 soques, la primera
coexpressa el gen HAC1 de forma induïble sota el promotor AOX i la segona ho realitza
de forma constitutiva sota el promotor GAP. Quan s’utilitza la soca que coexpressa el
gen de forma induïble, es troben millores significatives (augment de 1.5 vegades de la
productivitat) al realitzar una estratègia amb substrats mixtes (sorbitol i metanol) a les
condicions prèviament optimitzades. Quan s’utilitza la soca que coexpressa el gen de
forma constitutiva, no es presenten millores en el procés de producció. / The objective of this thesis was to optimize the production of Rhizopus oryzae lipase
in fed-batch mixed substrate conditions with a Pichia pastoris Muts strain.
A milibioreactors bloc of 48 reactors with 12 ml working volume was tested to
optimize the culture conditions under fed-batch strategy. When Mut+ and Muts
phenotypes were used under AOX and FLD promoters, no satisfactory growth was
observed, related with a deficiency presented by the cooler system allowing a lose of
methanol of 0.5 gMet l-1 h-1. However, when Pichia pastoris under the constitutive
promoter GAP was used, satisfactory growth was observed obtaining similar values
than the ones obtained at higher volumes (5 l). In conclusion the 48 milibioreactors bloc
represents an excellent tool to optimize the ROL production under GAP promoter,
although was not satisfactory under AOX and FLD promoters.
Subsequently to the advantage of using mixed substrates in place of using methanol
as a sole carbon source, some experiments were done to optimize the ROL production
under fed-batch conditions using sorbitol and glycerol as cosubstrats. When sorbitol
was used the specific growth rate was maintained on 0.01 i 0.02 h-1 by a preprogrammed
exponential feed. Methanol set-point concentration was maintained on 0.5,
2 i 4 g l-1 controlled by a predictive algorithm. Lipolytic activity, yields, productivity
and specific productivity, but also specific growth, consumption and production rates
were analyzed showing that the best values were reached when methanol concentration
was fixed on 2 g l-1 showing an important reduction when this set-point was increased
or decreased, independently of the specific growth rate used. The experiments showed
that the key parameter was the set-point of methanol. On the other hand the specific
growth influence was not representative. Finally a SIA analyser of sorbitol was tested.
Sorbitol is considered an excellent cosubstrat but this low μmax in comparison with
other possible cosubstrats, assures low productions. Different experiments using
glycerol as cosubstrat were made at a constant methanol set-point of 2 g l-1, at three
different glycerol feeding rates to assure a constant specific growth rate of 0.02, 0.05
and 0.1 h-1, by means of a pre-programmed exponential feeding rate strategy. The best
production values were reached at the lowest specific growth rate tested. With Muts
phenotype glycerol could not increase the productivity of the process comparing with
sorbitol due to inhibitory effect on methanol consumption and recombinant lipase
production. The specific growth relation must be fixed lower than 6 (μGli μMet
-1), to avoid AOX promoter repression.
The scale-up of the most effective process was done using a Biostat UD50 (30 l
working volume). Methanol concentration was fixed on 0.02 h-1 and the specific growth
rate was fixed on 0.02 h-1 by a sorbitol pre-programmed exponential feed. An
encouraging scale-up was assumed (better KLa and similar geometry), although the first
feed-batch cultivations under this conditions did not reproduced the values obtained
under lab scale (5 l). Problems were related to the unsuccessful distribution (maximal
gradient was 0.5 gMet l-1) of the substrates along the different height of the reactor.
Methanol addition was submerged to the half height of the reactor to improve substrate
distribution along the reactor. Feed-batch cultivation was done, and ROL production
values were increase about 48%, in comparison with result obtained when methanol was added by the reactor headspace. And important increase was obtained, but is still necessary further research to reproduce values obtained in lab-scale.
Finally a new Pichia pastoris strain construction co-expressing constitutively and
inductively HAC 1 gene was used to optimize ROL production. Feed- batch cultivations
were done using methanol and sorbitol as cosubstrats under the same conditions
previously optimize (methanol concentration on 2 g l-1 and μ on 0.02 h-1). When
inductively co-expression was used important improvements were obtained on
productivity and specific productivity. On the other hand, when constitutively coexpression
was used, inferior production values were obtained in comparison with
results obtained with the non engineered strain.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/42007 |
| Date | 15 April 2011 |
| Creators | Arnau Jiménez, Carol |
| Contributors | Valero Barranco, Francisco, Casas Alvero, Carles, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | Catalan |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 310 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
Page generated in 0.0033 seconds