Les cellules s'acclimatent à leur environnement en décodant les signaux extracellulaires et en formant des complexes protéiques spécifiques afin d'entamer une réponse biologique adéquate. Par exemple, la liaison des récepteurs tyrosines kinases (RTK) à leurs ligands extracellulaires active de nombreuses voies de signalisation en créant des sites phosphotyrosines (pTyr) pouvant servir de points d'ancrage pour des protéines cytoplasmiques. Le recrutement de protéines adaptatrices, qui sont constituées uniquement de domaines modulaires médiant des interactions protéiques et qui ne contiennent aucune activité catalytique, au niveau de RTK activés favorise l'assemblage de complexes protéiques spécifiques. La formation de ces complexes permet le réarrangement des réseaux d'interactions protéine-protéine (IPP), ce qui est un processus essentiel pour l'homéostasie cellulaire. Néanmoins, les mécanismes moléculaires permettant la régulation des fonctions des protéines adaptatrices restent peu caractérisés à ce jour. Dans le cadre de ce projet de doctorat, nous avons identifié une nouvelle boucle d'autorégulation négative existante entre des RTK et des protéines adaptatrices constituées de domaines d'homologie à SRC 3 (SH3). Cette famille de domaines cible des peptides riches en proline et est fréquemment retrouvée dans les protéines impliquées dans la transduction de signaux. Nous avons déterminé que le RTK EPHA4 phosphoryle directement une tyrosine située dans les poches de liaisons des trois domaines SH3 des protéines adaptatrices NCK1 et NCK2, ce qui inhibe leur capacité à interagir avec leurs partenaires protéiques. De plus, nous avons observé que ce résidu tyrosine est conservé à cette position dans plus de la moitié des 300 SH3 humains. Nos résultats suggèrent que plusieurs RTK pourraient phosphoryler des domaines SH3, et donc inhiber la transduction de signaux directement au niveau du récepteur activé à la membrane plasmique. Les modules SH3 représentent une des familles de domaines les plus répandus et médient une proportion importante des IPP des cellules eucaryotes. Les domaines modulaires ciblant des motifs peptidiques précis tels les SH3 possèdent leur propre structure tridimensionnelle qui est supposée être indépendante de leur protéine hôte. Ils sont donc généralement considérés comme étant des modules d'IPP autonome médiant des interactions via leur spécificité intrinsèque. C'est pourquoi de nombreux SH3 ont été étudiés in vitro, isolés de leur protéine hôte, au cours des deux dernières décennies. Cependant, nous ne savons pas si ces domaines sont nécessaires et suffisants pour dicter des IPP dans leur contexte protéique naturel in vivo. Pour répondre à cette question, nous avons délété systématiquement les domaines SH3 de la levure Saccharomyces cerevisiae dans le but d'identifier les interactions SH3-dépendantes in vivo. Afin de déterminer si les SH3 sont suffisants pour médier des IPP dans des cellules vivantes, nous avons échangé le domaine SH3 de la protéine liant l'actine Abp1 par tous les autres SH3 de la levure ainsi que par ceux de ses orthologues humains. Ces expériences ont mis en évidence que les domaines SH3 dictent rarement des interactions indépendamment de leur protéine hôte. De plus, nous avons observé que les modules SH3 peuvent affecter les IPP de leur protéine hôte, possiblement via des interactions allostériques. Finalement, nous avons déterminé que même le positionnement de ces domaines est critique pour les IPP et les fonctions de leur protéine hôte, par exemple l'endocytose et la séparation de phases, chez la levure et l'humain. Nos travaux démontrent clairement l'importance du contexte protéique des domaines SH3 et que les fonctions de ceux-ci dépendent de leur protéine hôte. Ces résultats améliorent considérablement notre compréhension du fonctionnement des domaines SH3 dans des cellules saines et lors de pathologies. / Cells adapt to their environment by decoding extracellular signals and forming specific protein complexes to initiate the correct biological response. For example, the activation of receptor tyrosine kinases (RTKs) following binding to their extracellular ligands regulates numerous signaling pathways by creating phosphotyrosine (pTyr) sites that can serve as binding motifs for cytoplasmic proteins. The recruitment of adaptor proteins, consisting only of modular protein interaction domains and containing no catalytic activity, at activated RTKs promotes the assembly of specific protein complexes. The formation of these complexes allows the rearrangement of protein-protein interaction (PPI) networks, which is an essential process for homeostasis. However, the molecular mechanisms regulating the functions of adaptor proteins remain poorly characterized. We identified a negative autoregulatory loop existing between RTKs and adaptor proteins containing SRC homology 3 (SH3) domains. This family of modules targets proline-rich peptides and is enriched in proteins involved in signal transduction. We have determined that the RTK EPHA4 directly phosphorylates a tyrosine located in the binding pocket of the three SH3 domains of the adaptor proteins NCK1 and NCK2, and that this inhibits their ability to interact with their protein partners via SH3-dependent associations. In addition, we observed that this tyrosine residue is conserved at this position in more than half of the 300 human SH3s. Our results suggest that several RTKs may phosphorylate SH3 domains, and therefore inhibit signal transduction directly at the sites of activated receptors at the plasma membrane. SH3s modules represent one of the most widespread families of domains and mediate a significant proportion of all PPIs in eukaryotic cells. Modular domains targeting precise peptide motifs such as SH3s have their own three-dimensional structure, which is independent of their host protein. They are therefore generally considered to be autonomous PPI modules mediating interactions via a domain-intrinsic specificity. Based on this, many SH3s have been studied in vitro isolated from their host protein, over the past two decades. However, we still do not know whether these domains are necessary and sufficient to dictate PPIs in their natural protein context in vivo. To answer this question, we systematically deleted SH3 domains of the yeast Saccharomyces cerevisiae to identify SH3-dependent interactions in vivo. In order to determine whether SH3 domains are sufficient to mediate PPIs in living cells, we exchanged the SH3 domain of the actin-binding protein Abp1 with all the other yeast SH3s as well as those of its human orthologs. These experiments demonstrated that SH3 domains rarely dictate interactions independently of their host protein. In addition, we observed that SH3s can affect their host's PPIs according to the domain sequence, possibly via allosteric interactions. Ultimately, we determined that even the positioning of these domains is critical for the PPIs and the functions, for example endocytosis and phase separation, of their host protein in yeast and humans. Our work clearly demonstrates the importance of the protein context of SH3 domains and that their functions depend on their host protein. These results considerably improve our understanding of the functions of SH3 domains in normal cells and in the context of pathologies.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/71849 |
| Date | 03 February 2022 |
| Creators | Dionne, Ugo |
| Contributors | Landry, Christian R., Bisson, Nicolas |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | thèse de doctorat, COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xxi, 268 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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