Les protéines appartenant à la famille S100 et les annexines interviennent lors de différents mécanismes membranaires vitaux. En effet, le complexe protéique S100A10-annexine A2 permettrait le recrutement d'une partie du C-terminal de la protéine AHNAK à la membrane en présence de calcium, avant de former une plateforme qui initierait la réparation membranaire. Cependant, aucune donnée moléculaire n'est à ce jour disponible sur la liaison membranaire de la S100A10 et du segment C-terminal d'AHNAK de ce complexe. Leur liaison membranaire doit donc être étudiée afin de mieux comprendre leurs rôles lors du processus de réparation membranaire. Afin de combler le manque de données sur le rendement et la quantité de S100A10 solubilisée et purifiée parmi la littérature existante, le protocole de surexpression et purification de la S100A10 a été optimisé dans un premier temps. La protéine a été identifiée par spectrométrie de masse et la stabilité de sa structure secondaire a été analysée par dichroïsme circulaire à différentes températures au cours du temps. La S100A10 obtenue est stable pendant au moins 60 jours à plusieurs températures, dont 20 °C, permettant d'effectuer des expériences biophysiques à température ambiante avec la protéine non-dénaturée. En parallèle, le segment peptidique C-terminal d'AHNAK (pAHNAK) a été synthétisé commercialement. L'étude par spectroscopie infrarouge de réflexion totale atténuée (ATR) montre que sa structure secondaire ne subit pas de changement majeur en présence et en absence de lipides. Deux modèles membranaires ont été choisis dans nos études. D'abord, celui des monocouches de Langmuir a été utilisé pour mimer les membranes cellulaires afin de caractériser l'interaction des protéines avec différents phospholipides composant les membranes. Les études de la liaison membranaire de ces protéines ont été effectuées avec ce modèle en le couplant avec la tensiométrie de surface. Ces travaux ont démontré que le pAHNAK interagissait plus fortement avec les lipides insaturés, en particulier les lipides monoinsaturés, qu'avec les lipides saturés. De plus, le pAHNAK interagit préférentiellement avec la tête polaire des phospholipides de type phosphatidylsérine (PS), qui sont chargées négativement, puis avec ceux de type phosphatidyléthanolamine (PE) et enfin avec ceux de type phosphatidylcholine (PC). Avec le même modèle, la profondeur d'insertion des protéines dans des monocouches lipidiques a été déterminée par ellipsométrie. Les expériences avec des phospholipides monoinsaturés démontrent que la profondeur d'insertion du pAHNAK suit la même tendance (PS˃PE˃PC). Le deuxième modèle employé est celui des bicouches lipidiques avec lequel l'affinité de ces protéines pour les têtes polaires des phospholipides a spécifiquement été évaluée par résonance magnétique nucléaire (RMN) du ³¹P à l'état solide. Ces études de RMN confirment la tendance de préférence du pAHNAK pour les différents types de phospholipide à 37 °C observée précédemment. La liaison membranaire de la S100A10 a ensuite été étudiée selon la même stratégie que pour le pAHNAK. Les résultats de la tensiométrie montrent que la S100A10 préfère interagir avec les phospholipides insaturés avec des têtes polaires PE ou PS, et surtout les phospholipides polyinsaturés contenant de longues chaînes acyles. Les expériences d'ellipsométrie suggèrent que la S100A10 suit l'ordre d'insertion PC > PE > PS, ce qui pourrait être expliqué par un changement d'orientation de la protéine. De plus, les résultats de RMN suggèrent qu'à 20 °C et à 37 °C, la S100A10 pourrait s'insérer partiellement dans la membrane près des têtes polaires PS. L'ensemble de nos travaux de recherche démontrent que, dans un environnement physiologique à 37 °C, le pAHNAK et la S100A10 peuvent probablement interagir avec des phospholipides monoinsaturés ayant une tête polaire chargée négativement. Cependant, le pAHNAK aura tendance à s'insérer dans les chaînes acyles alors que la S100A10 s'insérerait partiellement près des têtes polaires. Ce projet a ainsi permis de développer les connaissances sur la liaison membranaire de la protéine S100A10 et du pAHNAK et d'émettre de nouvelles hypothèses quant au rôle des PS dans la réparation membranaire. De plus, la poursuite de ces travaux mènera à l'identification potentielle des conditions conduisant à une modification de leur liaison membranaire, et éventuellement à une perte de fonction. Ainsi, les connaissances développées dans cette thèse permettent de mieux comprendre la liaison membranaire de la S100A10 et du C-terminal d'AHNAK afin de mieux déterminer leurs rôles dans la réparation membranaire, ainsi que dans les autres mécanismes physiologiques auxquels ces protéines participent. / Proteins belonging to S100 family proteins and annexins are involved in various vital membrane mechanisms. The S100A10-annexin A2 protein complex was postulated to recruit part of the C-terminal segment of the AHNAK protein to the membrane in the presence of calcium, before forming a platform which can initiate membrane repair. However, no molecular data is currently available on the membrane binding of S100A10 and of the C-terminal segment of AHNAK of this complex. Their membrane binding should therefore be studied in order to better understand their roles during the membrane repair process. In order to fill the lack of data on the yield and the quantity of purified and solubilized S100A10 in the existing literature, the protocol for the overexpression and purification of S100A10 was first optimized. The protein was identified by mass spectrometry and its secondary structure stability was analyzed by circular dichroism at different temperatures over time. The S100A10 obtained is stable for at least 60 days at several temperatures, including 20 °C, allowing to perform biophysical experiments at room temperature with a non-denatured protein. In parallel, the C-terminal peptide segment of AHNAK (pAHNAK) was commercially synthesized. Attenuated total reflection infrared spectroscopy (ATR) study shows that its secondary structure does not undergo major changes in the presence and absence of lipids. Two membrane models were chosen in our studies. First, the Langmuir monolayers model was used to mimic cell membranes in order to characterize the interaction of proteins with the different phospholipids found in membranes. Membrane binding studies of these proteins were carried out with this model by coupling it with surface tensiometry. This work demonstrated that pAHNAK interact more strongly with unsaturated lipids, in particular monounsaturated lipids, than with saturated lipids. In addition, pAHNAK preferentially interacts with the phosphatidylserine (PS) polar head group which is negatively charged, then with phosphatidylethanolamine (PE) and finally with phosphatidylcholine (PC). With the same model, the insertion depth of pAHNAK into lipid monolayers was determined by ellipsometry. Experiments with monounsaturated phospholipids demonstrate that the insertion depth of pAHNAK follows the same trend (PS˃PE˃PC). The second model membrane used is lipid bilayers with which the affinity of pAHNAK for phospholipid polar head groups has specifically been evaluated by solid state ³¹P nuclear magnetic resonance (NMR). These NMR studies confirm the previously observed preference trend of pAHNAK at 37 °C for the different polar head groups. The membrane binding of S100A10 was then studied according to the same strategy as pAHNAK. The results of the tensiometry show that S100A10 prefers to interact with unsaturated phospholipids bearing PE or PS polar head groups, and especially polyunsaturated ones containing long fatty acyl chains. Ellipsometric experiments suggest that S100A10 follows the order of insertion PC> PE> PS, which could be explained by a change in orientation of the protein. Moreover, NMR results suggest that, at 20 and 37 °C, S100A10 could partially insert into the membrane near the PS polar head group. All of our research demonstrates that, in a physiological environment of 37 °C, pAHNAK and S100A10 can probably interact with monounsaturated phospholipids containing a negatively charged polar head group. However, pAHNAK will tend to insert into the acyl chains while S100A10 would insert partially near the polar head group of phospholipids. This project has thus made it possible to develop knowledge on the membrane binding of the S100A10 protein and of pAHNAK as well as to provide new hypotheses regarding the role of PS in membrane repair. In addition, the continuation of this work will lead to potentially identify the conditions leading to a modification of the membrane binding of these proteins, and possibly to a loss of function. Thus, the knowledge developed in this thesis allows to improve our understanding of the membrane binding of S100A10 as well as of the C-terminal segment of AHNAK in order to better determine their roles in membrane repair, as well as in other physiological mechanisms in which these proteins are involved.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/105243 |
| Date | 15 December 2022 |
| Creators | Yan, Xiaolin |
| Contributors | Boisselier Mailfait, Élodie |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xxv, 170 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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