O sistema de expressão em Escherichia coli foi o primeiro a ser utilizado para produzir produtos farmacêuticos recombinantes e tem muitas vantagens quando comparado com sistemas eucarióticos, como o fácil cultivo, baixo custo e alto potencial de produção. O fator estimulador de colônias de granulócito (G-CSF) atua principalmente promovendo a maturação dos neutrófilos e estimulando sua atividade fagocítica e quimiotática, além de estar envolvido com o processo de segmentação nuclear dessas células. O fator estimulador de colônias de granulócitos humano recombinante (rhG-CSF) tem sido produzido por engenharia genética em Escherichia coli, e é usado no tratamento de diversas patologias, sobretudo em neutropenias provocadas pela quimioterapia usada no tratamento de tumores, pela radioterapia e pelo uso de drogas que suprimem a produção de células mieloides. Desse modo, o presente estudo teve como objetivo a expressão da proteína rhGCSF em bactérias Escherichia coli. A clonagem do gene rhG-CSF no vetor de expressão pET-28a(+) foi realizada nos sítios de restrição das enzimas EcoRI e XhoI, e a expressão da proteína recombinante em cepas de bactéria Escherichia coli BL21DE3 foi obtida com sucesso. A proteína rhG-CSF, fundida à cauda de seis histidinas, foi purificada com êxito e identificada pelas técnicas de Western Blotting e por espectrometria de massas. São necessários estudos para avaliar a integridade estrutural e atividade biológica da proteína produzida, que se confirmada, possibilita que esta seja produzida em escala piloto. / The expression system in Escherichia coli was the first to be used to produce recombinant pharmaceuticals and has many advantages compared to eukaryotic systems, such as easy cultivation and high production potential at low costs. The granulocyte colony (G-CSF) stimulating factor acts primarily by promoting the maturation of neutrophils and stimulating their phagocytic and chemotactic activity. G-CSF is also involved with the process of neutrophils nuclear segmentation. The recombinant human granulocyte colonies stimulating factor (rhG-CSF) has been produced by genetic engineering in Escherichia coli, and it is used to treat of several conditions, especially neutropenia caused by chemotherapy used in the treatment of tumors, by radiotherapy and by the use of drugs that suppress the production of myeloid cells. The present study aimed the expression of rhG-CSF protein in Escherichia coli bacteria. The cloning of rhG-CSF gene in the expression vector pET- 28a (+) was carried out on the restriction sites of the EcoRI and XhoI enzymes. Expression of the recombinant protein in Escherichia coli BL21DE3 was successfully achieved. The rhG-CSF protein, fused with a six histidine tag, was obtained and successfully purified and identified by the Western Blotting and by mass spectrometry techniques. Studies are needed to assess the structural integrity and biological activity of the protein produced, which, if confirmed, enables the production on a pilot scale.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-17042015-112052 |
| Date | 03 September 2014 |
| Creators | Fillipe Luiz Rosa do Carmo |
| Contributors | Elisa Maria de Sousa Russo, Hamilton Cabral, Taísa Magnani Dinamarco |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Biociências Aplicadas à Farmácia, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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