Coronaviren sind mit einer Genomgröße von 27-32 kb die größten bekannten RNA-Viren. Sie infizieren ein breites Spektrum von Vertebraten und führen zu beträchtlichen wirtschaftlichen Schäden in der Tierzucht. Eine zentrale Regulationsebene im coronaviralen Lebenszyklus stellt die proteolytische Prozessierung dar. Sie führt zur Freisetzung der einzelnen funktionellen Proteinkomponenten des Replikationskomplexes. Eine Schlüsselfunktion in diesem Prozess haben die viruskodierten 3C-like-Proteasen, die aus diesem Grund attraktive Zielmoleküle für die Entwicklung anticoronaviraler Therapien darstellen. Eine wichtige Voraussetzung für die Entwicklung effektiver und selektiver Inhibitoren stellt die biochemische und strukturelle Charakterisierung der Coronavirus-3C-like-Protease (3CLpro) dar. In der vorliegenden Arbeit wurde die Substratspezifität der coronaviralen 3C-like-Proteasen in vitro untersucht. Dazu wurden zunächst fünf verschiedene coronavirale 3C-like-Proteinasen (FIPV-, TGEV-, HCoV-, MHV- und IBV-3CLpro) rekombinant als MBP-3CLpro-Fusionsproteine in E.coli exprimiert. Die 3CLpro-Domäne des felinen Coronavirus FIPV wurde dabei erstmals kloniert und sequenziert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz der FIPV-3CLpro wurde mit der anderer coronaviraler 3C-like-Proteasen verglichen und ergab eine außerordentlich enge phylogenetische Verwandschaft von FIPV und TGEV. Die MBP-Fusionsproteine wurden affinitätschromatographisch aufgereinigt und die authentischen 3C-like-Proteasen durch die Abspaltung des MBP mittels Endoproteinase Faktor Xa freigesetzt. Alle gereinigten 3C-like-Proteasen zeigten Transspaltungsaktivität gegenüber synthetischen Peptiden und konnten somit für die biochemische Charakterisierung verwendet werden. Kompetitive Spaltungsassays mit den 3C-like-Proteasen von HCoV, TGEV und MHV und synthetischen Peptiden, die verschiedene Spaltstellen im coronaviralen Replikasepolyprotein repräsentieren, ergaben eine Schnittstellenhierarchie, die über Speziesgrenzen hinweg konserviert ist. Übereinstimmend konnte für die HCoV-, TGEV- und MHV-3C-like-Protease gezeigt werden, dass die die 3CLpro flankierenden Schnittstellen am effektivsten hydrolysiert werden. Diese Daten lassen auf eine frühzeitige (möglicherweise kotranslationale) Freisetzung der 3C-like-Protease aus dem viralen Polyprotein schließen, die eine weitgehend in trans erfolgende Prozessierung der viralen Polyproteine zur Folge hätte. Interessanterweise wurde das die aminoterminale HCoV-3CLpro-Schnittstelle repräsentierende Peptid von allen getesteten coronaviralen 3C-like-Proteasen überaus effektiv gespalten, so dass diese Sequenz als Grundlage für die Entwicklung eines für Coronaviren universellen Substrates in einem sensitiven, kontinuierlichen Assay für Coronavirus-3C-like-Proteasen dienen konnte. Dieser auf einem fluorogenen Substrat basierende Assay erweitert das Spektrum der bisher verfügbaren analytischen Methoden zur Charakterisierung der coronaviralen 3C-like-Proteasen und könnte in modifizierter Form auch für andere virale Proteasen verwendet werden. Eine initiale Charakterisierung mit klassenspezifischen Inhibitoren zeigte die Eignung des Assays für ein high throughput screening (HTS) nach potentiellen 3CLpro-Inhibitoren, das eine wichtige Technik der pharmazeutischen Industrie für die schnelle und effiziente Suche und Optimierung relevanter Verbindungen darstellt. Für das rationale Design 3CLpro-spezifischer Inhibitoren ist die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur essentiell. Von besonderem Interesse ist dabei die Aufklärung der strukturellen Grundlagen der Substratspezifität. Auf der Suche nach coronaviralen 3C-like-Proteasen mit guten Kristallisationseigenschaften wurden im Rahmen dieser Arbeit für die FIPV- und TGEV-3CLpro Reinigungsprozeduren etabliert, die zu hochgereinigten Proteinen mit relativ guten Kristallisationseigenschaften führten, die gute Voraussetzungen für eine röntgenkristallographische Strukturanalyse schaffen. / With genome sizes between 27,000 and 31,000 nucleotides, coronaviruses are the largest RNA viruses known to date. They infect a broad range of vertebrates and cause considerable economic losses in animal breeding. Proteolytic processing of large polyprotein precursors generates the individual functional subunits of the replication complex and thus represents a central regulatory mechanism in the replication cycle of coronaviruses. In this process, the coronavirus 3C-like proteases play a key role and, for this reason, they represent ideal targets for the design of inhibitors to control coronavirus infections. To develop effective and selective enzyme inhibitors, a comprehensive biochemical and structural characterization of the 3C-like protease (3CLpro) is required. In this study, the substrate specificities of coronaviral 3C-like proteases were characterized in vitro. To this end, five different 3C-like proteases (from FIPV, TGEV, HCoV-229E, MHV und IBV) were recombinantly expressed as fusion proteins with the Escherichia coli maltose-binding protein. The complete coding region of the FIPV 3C-like protease was cloned and sequenced for the first time. Upon comparison of the deduced amino acid sequence with the replicase polyprotein sequences of other coronaviruses a close phylogenetic relationship between FIPV and TGEV was revealed. The MBP-3C-like protease fusion proteins were purified by affinity chromatography and the authentic 3C-like proteases were released from the fusion protein by factor Xa cleavage. All recombinant proteases were shown to be active in synthetic peptide-based trans-cleavage assays and, thus, they were suitable for further biochemical characterization. Competition experiments using the purified 3C-like proteases of HCoV, TGEV and MHV, respectively, and peptide substrates representing pp1a/pp1ab cleavage sites revealed a specific ranking of cleavage sites. This ranking proved to be conserved among coronaviruses. The data consistently showed that the sites which flank the 3C-like proteases are most effectively cleaved. It thus seems reasonable to conclude that the release of 3CLpro from the viral polyprotein may be an early, possibly cotranslational step in the pp1a/pp1ab processing pathway. If this hypothesis is correct, most 3CLpro-mediated cleavages would occur in trans. Interestingly, the peptide substrate containing the aminoterminal HCoV 3CLpro cleavage site was cleaved very efficiently by all the coronaviral 3C-like proteases tested in this study. Therefore, the sequence of this peptide was used to develop a universally applicable, sensitive fluorometric assay suitable for the characterization of coronavirus 3C-like proteases and the identification and evaluation of inhibitors. This peptide-based fluorogenic assay not only significantly extends the spectrum of analytical methods in the characterization of coronavirus 3C-like proteases but, in a modified form, could also be applied for other viral proteases. The initial characterization of this novel assay using class-specific protease inhibitors demonstrated its suitability for high-throughput screening (HTS) applications which are widely used in the pharmaceutical industry to identify inhibitory lead compounds from large compound libraries generated by combinatorial chemistry. Structural information is essential for the rational design of 3CLpro-specific inhibitors. In this respect, the elucidation of the structural basis for subrate recognition is of particular interest. In an attempt to identify coronaviral 3C-like proteases with favourable crystallization properties, protocols for the purification of the FIPV and TGEV 3C-like proteases were developed in this study. The established methods proved to be suitable to produce large amounts of highly purified enzymes with significantly improved crystallization properties and thus provide a good basis for structure analyses by X-ray crystallography.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:13 |
| Date | January 2001 |
| Creators | Hegyi, Annette |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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