Le système de sécrétion de type II (SST2) permet la sécrétion de protéines repliées à travers la membrane externe chez les bactéries à Gram-négatif. Le SST2 est une nano-machine enchâssée dans l’enveloppe bactérienne, proche par sa composition et structure aux systèmes d’assemblage des pili de type IV (PT4) impliqués, entre autres, dans d’adhésion et motilité. Chez Klebsiella oxytoca, la surexpression des gènes pul codant le SST2 permet l’assemblage de pili composées des sous-unités PulG. Ceci suggère qu’en conditions physiologiques l’assemblage d’un pseudopilus périplasmique permet la sécrétion du substrat spécifique du SST2, la pullulanase. Dans ce projet nous avons exploré le mécanisme moléculaire de l’assemblage du pseudopilus en se focalisant sur les interactions de PulG avec les composants du SST2 dans la membrane interne. En utilisant l’approche de double-hybride bactérien, nous avons établi le réseau d’interactions de PulG avec les pseudopilins mineures PulH, I, J et K et avec la plateforme d’assemblage (PA). Pour valider ces interactions, nous avons combiné des techniques de biochimie (co-purification par affinité, pontage cystéine et chimique) avec des analyses fonctionnelles de sécrétion et de formation du pseudopilus. Nous avons mis en évidence des interactions entre PulG et les protéines de la PA, PulF et PulM, et nous avons analysé en détail l’interface PulG-PulM. Les résultats suggèrent la formation d’un complexe PulK-I-J-H-G dans la membrane interne impliqué dans des étapes précoces de la formation du pseudopilus, à travers les interactions de PulG et PulH avec PulM et PulF. Nos données expérimentales suggèrent un rôle majeur de PulM dans la sécrétion, vraisemblablement durant l’assemblage du SST2 et l’élongation du pseudopilus. Nos travaux collaboratifs mettant en jeu l'analyse par spectroscopie de masse et en dynamique moléculaire in silico révèlent le rôle essentiel des résidus conservés Glu5 et Thr2 de PulG, requis pour l’interaction avec PulM. Ces données suggèrent que Glu5 participe à l'extraction de PulG de la membrane, en neutralisant la charge positive de son peptide N-terminal par des interactions intramoleculaires. Ces résultats permettent d'établir un modèle détaillant les étapes initiales de l’assemblage des pseudopili dans la membrane interne, relevant pour de futures études sur le SST2 et nanomachines homologues. sécrétion de protéinespili de type 4 assemblage de fibres complexes protéiques membranairesinteractions protéine-protéinemicroscopie à immuno-fluorescence simulations en dynamique moléculairedouble-hybride bactérien spectrométrie de masse nanomachines bacteriennes / The type II secretion system (T2SS) drives the translocation of folded, periplasmic proteins across the outer membrane in Gram-negative bacteria. Secretion is carried out by an envelope-spanning nanomachine that is similar to the apparatus that builds type IV pili (T4P), bacterial surface filaments involved in adhesion, motility and other functions. In the Pul T2SS of Klebsiella oxytoca, overexpression of pul genes in plate-grown bacteria allows the assembly of T4P-like surface fibres made of PulG subunits, suggesting that a periplasmic pseudopilus fibre plays a role in the secretion of the type II substrate pullulanase under physiological conditions. In this project, we explored the molecular mechanism of pseudopilus assembly by focusing on the interaction between PulG and the T2SS inner membrane and pseudopili components. The network of interactions of PulG with the minor pseudopilins PulH, I, J and K and the assembly platform (AP) components was established using bacterial two-hybrid analysis. To validate these interactions, we combined biochemical approaches (affinity co-purification, chemical or cysteine cross-linking) with functional assays of secretion and pseudopilus formation. We provide evidence of the interaction between PulG and the AP proteins PulF and PulM, and delve into the PulG-PulM interface. Our results point to the formation of a PulK-I-J-H-G complex in the plasma membrane involved in early steps of fibre assembly, with a determinant role for PulG and PulH interaction with PulM and PulF. We obtained experimental evidence supporting a major role for PulM in pseudopilus assembly and protein secretion, probably by intervening in the assembly of the T2SS apparatus and in pseudopilus elongation. The results of experimental and in silico studies in collaboration with experts in mass spectrometry and molecular dynamics support the essential role of the highly conserved PulG residues Glu5 and Thr2, which participate in PulM binding. In addition, Glu5 probably favours PulG membrane extraction by neutralising its N-terminal positive charge through intra-molecular interaction. These findings shed new light on early membrane events during fibre assembly, and open new and exciting avenues in research on T2SSs and related nanomachines.protein secretiontype 4 pilifibre assemblymembrane protein complexprotein-protein interactionsimmunofluorescence microscopymolecular dynamics simulationsbacterial two-hybrid assaymass spectrometrybacterial nanomachines
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2016USPCC216 |
| Date | 25 November 2016 |
| Creators | Santos Moreno, Javier |
| Contributors | Sorbonne Paris Cité, Francetic, Olivera, Tran Van Nhieu, Guy |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image |
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