L’étude de l’interaction entre des protéines et leurs ligands est essentielle pour la compréhension de leur rôle physiologique ainsi que de leur rôle dans la mise en place de pathologies. En particulier, dans le cas de maladies neurodégénératives, comme les maladies d’Alzheimer ou de Creutzfeld-Jacob, ou d’autres pathologies liées au mépliement de protéines, la compréhension des interactions entre protéines, qui peuvent modifier de façon considérable le paysage conformationnel des partenaires, est une des clés pour décrypter les étapes moléculaires élémentaires induisant une cascade d’événements qui mènent à la formation d’assemblages protéiques de grande taille. Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié la dynamique de taille de trois types d’assemblages protéines/ peptides.Interactions faibles impliquées dans la structuration d’assemblages de PrPSc et dans l’équilibre entre les formes PrPSc et suPrP : Dans un premier temps, l’étude des étapes précoces de la réplication du prion nous a permis de mettre en évidence une voie de diversification structurale qui implique une voie de templating secondaire. En utilisant une méthode de solubilisation en conditions natives et une approche reposant sur une série de souches différentes, nous avons démontré que, pour toutes les souches testées, les assemblages de prion ont la propriété de se dépolymériser en deux ensembles discrets d’assemblages oligomériques, dont la taille varie entre des dimères et tétramères. Des approches d’amplification de prion in vitro et in vivo ont démontré que ces assemblages oligomériques comportent toute l’information nécessaire à la réplication ainsi que les déterminants structuraux de la souche. Le motif de glycosylation, la cartographie par épitopes ainsi que l’empreinte PK ont mis en évidence des différences structurales entre les espèces oligomériques, soulignant la coexistence d’ensembles d’assemblages structuralement distincts au sein d’une souche donnée. Des expériences de dépliement partiel ont montré la présence d’une dynamique constitutionnelle entre les assemblages reposant sur un échange de matière et un réarrangement structurel à l’échelle de l’unité élémentaire (suPrP) ainsi qu’une diversité structurale au sein des assemblages de prion.Partenaires et oxydation de la PrPc: Bien que des travaux préalables aient mis en évidence l’existence d’interactions entre PrP et Aβ, Aβ1-40 ne forme que des complexes très instables avec la PrP monomérique. La spectrométrie de masse n’a pas permis de mettre en évidence cette interaction, même après optimisation des paramètres en conditions natives ou via des mesures indirectes reposant sur des échanges hydrogène - deutérium d’amide. L’oxydation radioloytique de la PrPC a été étudiée par SEC couplée à la mobilité ionique et la spectrométrie de masse, montrant la formation d’assemblages de haut poids moléculaires associée à des changements de structure.Fortes interactions peptide/peptide : Le système Synapt G2Si (Waters), qui combine de la mobilité ionique avec de la spectrométrie de masse, a été utilisé pour l’analyse d’une série de peptides issus de la capside externe du birnavirus de l’IBDV. Ces peptides peuvent former des complexes avec des énergies de liaison intermoléculaires proches de l’énergie de la liaison peptidique. En plus de la mise en évidence des changements structuraux au sein de ces complexes liés à l’introduction de mutations dans la séquence peptidique, des déviations par rapport aux attentes expérimentales ont été observées au cours de ce travail lors de mesures en conditions de mobilité ionique. Ces écarts ont pu être reliés à la conception de la cellule Tri-Wave de l’instrument, qui conduit à un mélange des différents gaz tampon qui ne peut être évité. De ce fait, les biais introduits par ce mélange influencent les paramètres de modélisation et la comparaison entre instruments pour tous les utilisateurs de ce modèle d’instrument. / Interactions between proteins and their ligands play a crucial in the understanding of their physiological function as well as their role in disease mechanisms. Especially in all forms of neurodegenerative diseases like Alzheimer, Creutzfeld-Jacob disease and others pathologies due to protein misfolding, the understanding of protein interaction, which can cause a dramatic change in the conformational landscape of the binding partners, is key in the deciphering of elementary molecular steps leading to cascade of events finally resulting in the formation of large protein assemblies. In the scope of this thesis we studied the size dynamic of three types of protein/peptides assemblies.Weak interactions involved in the structuration of PrPSc assemblies and in the detailed balanced between PrPSc and suPrP: The earliest steps in prion protein conversion were studied using both in vitro bona fide prion amplification method. We showed that the early step of the replication leads to a deterministic diversification process involving a secondary templating pathway. Furthermore, by using a native solubilization method and through a multi-strain approach. We demonstrated a generic property of prion assemblies to depolymerize into two discreet sets of oligomeric assemblies with a size ranging between dimers and tetramers for all tested strains. Both in vitro and in vivo prion amplification approaches showed that the oligomeric assemblies harbour all the replicative information as well as the strain structural determinant. Glycopattern, epitope-mapping and PK fingerprint revealed structural differences between the oligomeric species highlighting the coexistence of structurally distinct set of assemblies within a given strain. Partial unfolding experiments demonstrated the existence of a constitutional dynamic between the assemblies based on material exchange and structural rearrangement at the level of the elementary subunits (suPrP).PrPc partners and oxidative modifications: Although previous work had shown the existence of interactions between PrP and Aβ, monomeric Aβ1-40 forms only very weak complexes with monomeric PrP and mass spectrometry, even after optimization of the native instrument settings or by indirect measurements based on amide hydrogen deuterium exchange was not able to detect this interaction. Oxidation of PrPc was also suggested as a pathway towards pathology: the appearance and structural changes induced by gamma-radiolysis of water on PrPc were studied by mass spectrometry and ion mobility.Strong peptide/peptide interactions: The Waters Synapt G2Si instrumental set-up which couples ion mobility with mass spectrometry was used for the analysis of a collection of peptides derived from the shell of the IBDV binavirus. These peptides can form complexes with binding energies close or similar to the binding energy of the peptide bond. In addition to a better description of the changes in structure of these complexes varying with the mutations introduced in peptide sequence, we observed deviation from expected instrument characteristics when performing ion mobility measurements. Due to the design of the Tri-wave module in the Waters Synapt G2Si mass spectrometer, a mixture of the different buffer gases intrinsically cannot be avoided. Consequently, these biased measurements influence the outcome of modelling approaches and the inter-instrument comparison for all users of this instrument type.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2019SACLS284 |
| Date | 26 September 2019 |
| Creators | Bohl, Jan |
| Contributors | Paris Saclay, Van der Rest, Guillaume |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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