La détection et l’identification des protéines sur gel d’électrophorèse dépend aussi bien du marqueur des protéines utilisés (généralement un marqueur fluorescent) que de ses propriétés physicochimiques propres (rendement quantique, Stokes’ shift et recouvrement des bandes d’absorption et d’émission, photoblanchiment), de sa stabilité (chimique et photochimique), et de son accessibilité. Créer une gamme de nouveaux fluorophores dont les propriétés physicochimiques peuvent être modulées en partant d’une structure bien connue et très avantageux dans l’optique d’anticiper les caractéristiques supposées des composées envisagés. Cependant, même si de nombreux fluorophores sont disponibles commercialement, ils souffrent généralement de différentes contraintes telles que leurs prix prohibitifs, leur manque de sensibilité, leur stockes’ shift trop faible ou bien encore leur stabilité. L’accès à une famille de fluorophores résolvant l’ensemble de ces contraintes pour la détection de protéines sur gel d’électrophorèse représenterait donc un réel défi. L’épicocconone, isolée du champignon Epicoccocum Nigrum, se lie de façon covalente aux amines (et donc également aux protéines) en conduisant à un adduit énaminique qui est très fluorescent. Cet adduit émet dans le rouge (610 nm) lorsqu’irradié dans l’UV (395 nm) ou le visible (520 nm). Ces propriétés ont donc conduit à l’utilisation de ce produit naturel comme marqueur fluorescent de protéines sur gel d’électrophorèse menant à une sensibilité de détection rarement atteinte et à une gamme de linéarité très importante (104). La première synthèse de l’épicocconone a alors été engagée au sein de notre laboratoire. Elle a finalement conduit à une chimiothèque d’analogues encore plus efficace ayant permis d’établir une véritable relation structure-fluorescence. / Detection and identification of proteins either in 2D electrophoresis gels or in biological media depends largely on the quality of protein sensitive dye used (generally a fluorescent dye) as well on the efficiency of their fluorescent properties (quantum yield, Stokes’ shift and overlap of excitation frequency with common laser sources), their stability (chemical and photophysical) and their accessibility. To be able to create a range of new fluorescent dyes whose profiles can be modulated starting from a proven scaffold is advantageous in terms of predicting the properties of the final products. Even if many fluorescent dyes are available on the market, they suffer from a prohibitive price, a lack of sensitivity or a restricted wavelength range (absorption/emission) or limited stability. Access to a family of fluorophores displaying similar physicochemical properties, but shifted excitation and emission wavelengths constitutes an invaluable tool Epicocconone, isolated from the fungus Epicoccum nigrum, covalently binds to primary amines (e.g. lysine of proteins), leading to a protein linked conjugate which is strongly fluorescent, emitting light in the red (610 nm) when submitted to UV-visible light (395 or 520 nm). This is a novel pro-fluorophore that allows protein quantification with unprecedented sensitivity and with an excellent linearity on a broad range of concentrations. A program of synthesis of epicocconone and analogues in order to provide a library of complementary fluorophores has been undertaken. The results concerning either the better efficiency of the analogs and the structure-fluorescence relation are presented in this dissertation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2009ISAM0014 |
| Date | 17 December 2009 |
| Creators | Peixoto, Philippe |
| Contributors | Rouen, INSA, Franck, Xavier |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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