Understanding the function of membrane proteins is crucial to elucidate the molecular mechanisms by which transmembrane signaling based physiological processes,i. e., the interactions of extracellular ligands with membrane-bound receptors, are regulated.
In this work, synthetic transmembrane segments derived from the visual photoreceptor rhodopsin, the full length system rhodopsin and mutants of opsin are used to study physical processes that underlie the function of this prototypical class-A G-protein coupled Receptor.
The dependency of membrane protein hydration and protein-lipid interactions on side chain charge neutralization is addressed by fluorescence spectroscopy on synthetic transmembrane segments in detergent and lipidic environment constituting transmembrane segments of rhodopsin in the membrane. Results from spectroscopic studies allow us to construct a structural and thermodynamical model of coupled protonation of the conserved ERY motif in transmembrane helix 3 of rhodopsin and of helix restructuring in the micro-domain formed at the protein/lipid water phase boundary.
Furthermore, synthesized peptides and full length systems were studied by time resolved FTIR-Fluorescence Cross Correlation Hydration Modulation, a technique specifically developed for the purpose of this study, to achieve a full prospect of time-resolved hydration effects on lipidic and proteinogenic groups, as well as their interactions. Multi-spectral experiments and time-dependent analyses based on 2D correlation where established to analyze large data sets obtained from time-resolved FTIR difference spectra and simultaneous static fluorescence recordings. The data reveal that lipids play a mediating role in transmitting hydration to the subsequent membrane protein response followed by water penetration into the receptor structure or into the sub-headgroup region in single membrane-spanning peptides carrying the conserved proton uptake site (monitored by the fluorescence emission of hydrophobic buried tryptophan).
Our results support the assumption of the critical role of the lipid/water interface in membrane protein function and they prove in particular the important influence of electrostatics, i. e., side chain charges at the phase boundary, and hydration on that function. / Für die Aufklärung der molekularen Wirkungsweise von physiologischen, auf Signaltransduktion, d. h. dem Zusammenspiel von extrazellulären Reizen und membrangebundenen Rezeptoren, beruhenden Prozessen ist das Verständnis der Funktion von Membranproteinen unerlässlich.
In dieser Arbeit werden von Rhodopsin abgleitete, synthetische transmembrane Segmentpeptide, Opsin-Mutanten und der vollständige Photorezeptor Rhodopsin untersucht, um die physikalischen Prozesse zu beleuchten, die der Funktionen dieses prototypischen Klasse-A G-Protein gekoppelten Rezeptors zugrunde liegen.
Die Abhängigkeit der Membranprotein-Hydratation und der Lipid-Protein-Wechselwirkung von der Ladung einer Aminosäuren-Seitenkette wird erforscht. Hierzu werden synthetische, transmembrane Segmentpeptide in Lipid und Detergenz, als Modell transmembraner Segmente von Rhodopsin in der Membran mittels Fluoreszenzspektroskopie untersucht. Aus den erhaltenen Ergebnissen wird ein thermodynamisches und strukturelles Modell hergeleitet, welches die Kopplung der Protonierung des hochkonservierten ERY-Motivs in Transmembranhelix 3 von Rhodopsin an die Restrukturierung der Helix in der Mikroumgebung der Lipid-Wasser-Phasengrenze erklärt. Des Weiteren werden sowohl die Segementpeptide als auch die vollständigen Systeme Opsin und Rhodopsin mittels zeitaufgelöster FTIR-Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Hydratations-Modulation untersucht. Diese Technik wurde eigens zur Aufklärung von zeitabhängigen Hydratationseffekten auf Lipide und Proteine oder Peptide entwickelt. Dabei werden zeitaufgelöste FTIR Differenz-Spektren und gleichzeitig statische Fluoreszenzsignale aufgenommen und diese zeitabhängigen multispektralen Datensätze mittels 2D Korrelation analysiert. Die Auswertung der Experimente enthüllt einen sequentiellen Hydratationsprozess. Dieser beginnt mit der Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen an der Carbonylgruppe des Lipids, gefolgt von Strukturänderungen der Transmembranproteine und abgeschlossen durch das Eindringen von Wasser in das Proteininnere. Letzteres wird nachgewiesen durch die Fluoreszenz von Tryptophan im hydrophoben Peptid- oder Proteininneren.
Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die Annahme, dass Lipid-Protein-Wechselwirkungen eine entscheidende Rolle in der Funktion von Membranproteinen spielen und das insbesondere Elektrostatik, in Form von Ladungen an der Phasengrenze, und die Hydratisierung einen kritischen Einfluss auf diese Funktion haben.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:24886 |
| Date | 26 January 2012 |
| Creators | Eichler, Stefanie |
| Contributors | Fahmy, Karim, Diez, Stefan, Hildebrandt, Peter, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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