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Previous issue date: 2011-02-18 / Financiadora de Estudos e Projetos / The proliferation of toxic algae in different oceans leads to great economic losses and environmental damage the mortality of marine animals such as mollusks and fish due to neurotoxins that they release into the environment. The reasons that lead to algal blooms are not fully understood and thus the monitoring of algae is extremely important. In this sense, the genosensors appear as promising tools for the detection of toxic algal blooms in coastal waters, as they offer the possibility of in situ detection with high sensitivity and selectivity. In this project we studied the processes of hybridization of DNA molecules without the use of marker molecules using electrochemical and microgravimetric techniques. Probes were used as partial sequences of primers of the gene encoding the ribosomal RNA sub-unit of the microalgae Alexandrium species. These species of algae produce neurotoxins that can accumulate in shellfish and are responsible for harm to human health. The probe DNA was immobilized by chemisorptions on the surface of a quartz crystal oscillating at 9 MHz third harmonic, 27 MHz. After the grounding of the probe, the crystals were exposed to target DNA molecules with sequence complementary to the probe and hybridization process was monitored in real time. The percentage of the crystal surface coverage and hybridization kinetics were monitored by quartz crystal microbalance (QCM). The area of the crystal suffered no links were filled with the reagent mercaptohexanol (MCH) and observed an improvement in the efficiency of hybridization. The cyclic voltammetry (CV) and electrochemical impedance spectroscopy (EIS) were used as a system for detection of DNA probe immobilization and hybridization with its complementary target, without the use of marker molecules. These events were monitored through changes in the electrical properties of the lead in media containing the redox couple [Fe(CN)6 3-/4-] before and after immobilization and hybridization. The analysis of xviii the impedance spectra showed an increase in Rct after the formation of doublestranded DNA, while the capacitance values remained unchanged after the modification of the electrode. The use of MCH during electrochemical measurements increased the efficiency of hybridization, in agreement with results obtained with the QCM technique. The technique of scanning electrochemical microscopy (SECM) was used to evaluate the charge transfer process before and after modifications to the DNA molecules. The results obtained with the SECM technique (approach curves) are qualitatively in agreement with results obtained by the techniques of QCM, CV and EIS with the redox couple [Fe(CN)6 3-/4-]. A microarray for DNA was constructed and evaluated, showing a good response in the detection of different nucleic acid sequences simultaneously. The genossensor developed allowed us to distinguish between targets and probes with different sequences, complementary and not complementary. A procedure for the regeneration of genossensor was developed and allowed the reuse of the DNA biosensor twenty times, with the same sensitivity. / A proliferação de algas tóxicas em diferentes oceanos pode causar perdas econômicas e ambientais devido a mortandade de animais marinhos como moluscos e peixes devido as toxinas que estas liberam no ambiente. Os motivos que levam a proliferação destas algas não são completamente compreendidos e desta forma o monitoramento das algas é de extrema importância. Neste sentido, os genossensores aparecem como ferramentas promissoras para a detecção de florações tóxicas em águas costeiras, uma vez que oferecem a possibilidade de detecção in situ com alta sensibilidade e seletividade. Neste projeto estudou-se os processos de hibridação de moléculas de DNA sem o uso de moléculas marcadoras utilizando técnicas microgravimétricas e eletroquímicas. Foram utilizadas como sondas sequências parciais de oligonucleotídeos do gene que codifica o RNA ribossômico de sub-unidade de microalgas da espécie Alexandrium. Estas espécies de algas produzem neurotoxinas, que podem acumular em moluscos e são responsáveis por danos à saúde humana. A sonda de DNA foi imobilizada por quimissorção na superfície de um cristal de quartzo de 9 MHz oscilando no terceiro harmônico, 27 MHz. Após a imobilização da sonda de DNA, os cristais foram expostos a moléculas alvo de DNA com sequência complementar à sonda e o processo de hibridação foi monitorado em tempo real. A porcentagem de recobrimento da superfície do cristal e a cinética de hibridação foram monitorados pela microbalança de cristal de quartzo (QCM). A área do cristal no qual as moléculas de DNA não foram imobilizadas foi preenchida com o reagente 6-mercapto 1-hexanol (MCH) e observou-se uma melhora na eficiência de hibridação. As técnicas de voltametria cíclica (VC) e espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) foram usadas como um sistema para detecção da sonda de DNA imobilizada e sua hibridação com o xvi alvo complementar, sem o uso de moléculas marcadoras. Estes eventos foram monitorados por meio da mudança nas propriedades elétricas do eletrodo em meio contento o par redox Fe(CN)6 3-/4- antes e após a imobilização e hibridação. As análises dos espectros de impedância mostraram um aumento na Rtc após a formação da dupla fita de DNA, ao passo que os valores de capacitância permaneceram inalterados após as modificações do eletrodo. O uso do MCH durante as medidas eletroquímicas aumentou a eficiência da hibridação, concordando com os resultados obtidos com a técnica de QCM. A técnica de microscopia eletroquímica de varredura (SECM) foi utilizada para avaliar o processo de transferência de carga, antes e após as modificações com as moléculas de DNA. Os resultados obtidos com a técnica de SECM (curvas de aproximação) estão qualitativamente de acordo com os resultados obtidos por meio das técnicas de QCM, CV e EIS com o par redox Fe(CN)6 3-/4-. Um sistema de arranjos de microeletrodos para DNA foi construído e avaliado, apresentando uma boa resposta na detecção de diferentes sequências de ácido nucléico simultaneamente. O genossensor desenvolvido permitiu distinguir entre sondas e alvos com sequências diferentes, complementares e não complementares. O procedimento utilizado para a regeneração do genossensor permitiu sua reutilização por no mínimo vinte vezes, sem perda na sensibilidade de detecção.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/6186 |
| Date | 18 February 2011 |
| Creators | Pedroso, Mariele Mucio |
| Contributors | Faria, Ronaldo Censi |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Química, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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