En recherche clinique ou environnementale, les biomarqueurs protéiques présentent un intérêt croissant. Bien que les immuno-dosages restent les méthodes de référence pour leur quantification, les récentes avancées en spectrométrie de masse (MS) font de cette technique une alternative crédible à l’ELISA. Ce travail apporte quelques éléments méthodologiques pour repousser certaines limitations de la MS. D’abord, deux dosages ont été proposés. Celui réalisé chez G. fossarum représente le premier exemple de dosage de la Vitellogénine chez un invertébré par LC-MS/MS. L’un des défis de la méthode présentée est de doser spécifiquement une protéine dans un organisme dont le génome est majoritairement inconnu. Le second dosage concerne les peptides contenant une méthionine. Nous avons développé un protocole d’oxydation des méthionines afin de s’affranchir du biais lié à leur oxydation partielle. Cette méthode a ensuite été appliquée à une protéine impliquée dans la maladie d’Alzheimer (l’Apolipoprotéine E4) dans une cohorte de 673 plasmas. Ce dosage est à ce jour l’une des plus grandes études réalisées par LC-MS/MS et montre toute la robustesse de cette approche. Enfin, l’influence de la phase mobile sur la sensibilité des dosages de peptides a été étudiée : d’abord en phase inverse, où le méthanol est une bonne alternative à l’acétonitrile ; ensuite en HILIC, où les difficultés liées à l’étude d’ions multichargés en milieu majoritairement organique ont été abordées. Les problèmes liés à la capacité de charge des colonnes ont également été soulevés. La chromatographie HILIC reste prometteuse pour la quantification de peptides puisqu’un facteur dix en sensibilité peut être apporté. / Both in clinical and environmental research, protein biomarkers are of growing interest. Although immunoassays are the gold standard for their quantification, recent advances in mass spectrometry (MS) make this technique a viable alternative to ELISA. This work provides some methodological elements to eliminate some limitations of the MS approach. First, two assays have been proposed. The first one achieved for G. fossarum represents the first example of quantification of vitellogenin in an invertebrate by LC-MS/MS. One of the challenges of the presented method is to specifically assay a protein in an organism whose genome is largely unknown. The second assay relates to methionine-containing peptides. A protocol was developped for total oxidation of methionines in order to overcome the bias due to their partial oxidation. This method was then applied to a protein involved in Alzheimer's disease (Apolipoprotein E4) in a cohort of 673 plasma samples. This assay is to date one of the largest study carried out by LC-MS/MS and shows all the robustness of this approach. Lastly, the influence of the mobile phase on the sensitivity of peptides assays was studied: first in reversed phase, where methanol is a good alternative to acetonitrile; then in HILIC, where the difficulties associated with the study of multicharged ions in a mainly organic content were discussed. Problems related to the carrying capacity of the columns were also raised.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2012LYO10106 |
| Date | 11 July 2012 |
| Creators | Simon, Romain |
| Contributors | Lyon 1, Salvador, Arnaud, Lemoine, Jérôme |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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