Les champignons mycorhizien à arbuscules (CMA) sont des organismes pouvant
établir des symbioses avec 80% des plantes terrestres. Les avantages d'une telle symbiose
sont de plus en plus caractérisés et exploités en agriculture. Par contre, jusqu'à
maintenant, il n'existe aucun outil permettant à la fois l'identification et la quantification
de ces champignons dans le sol de façon fiable et rapide. Un tel outil permettrait, entre
autres, de mieux comprendre les dynamiques des populations des endomycorhizes dans le
sol. Pour les producteurs d'inoculum mycorhiziens, cela permettrait également d'établir
un suivi de leurs produits en champs et d'avoir un contrôle de qualité de plus sur leurs
inoculants. C'est ce que nous avons tenté de développer au sein du laboratoire du Dr.
Hijri. Depuis environ une trentaine d'années, des outils d'identification et/ou de
quantification ont été développés en utilisant les profiles d'acides gras, les isozymes, les
anticorps et finalement l'ADN nucléaire.
À ce jour, ces méthodes d’identification et de quantification sont soit coûteuses,
soit imprécises. Qui plus est, aucune méthode ne permet à la fois la quantification et
l’identification de souches particulières de CMA.
L’ADN mitochondrial ne présente pas le même polymorphisme de séquence que
celui qui rend l’ADN nucléaire impropre à la quantification. C'est pourquoi nous avons
analysé les séquences d’ADN mitochondrial et sélectionné les régions caractéristiques de
deux espèces de champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA). C’est à partir de ces
régions que nous avons développé des marqueurs moléculaires sous forme de sondes et
d’amorces TaqMan permettant de quantifier le nombre de mitochondries de chacune de
ces espèces dans un échantillon d’ADN. Nous avons ensuite tenté de déterminer une
unité de quantification des CMA, soit un nombre de mitochondries par spore. C’est alors
que nous avons réalisé que la méthode de préparation des échantillons de spores ainsi que
la méthode d’extraction d’ADN avaient des effets significatifs sur l’unité de
quantification de base. Nous avons donc optimisé ces protocoles, avant d’en e tester
l’application sur des échantillons de sol et de racines ayant été inoculés avec chacune des
deux espèces cibles. À ce stade, cet outil est toujours semi-quantificatif, mais il permet
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l’identification précise de deux espèces de CMA compétentes dans des milieux saturés en
phosphore inorganique. Ces résultats , en plus d’être prometteurs, ont permis
d’augmenter les connaissances méthodologiques reliées à la quantification des CMA dans
le sol, et suggèrent qu’à cause de leurs morphologies différentes, l’élaboration d’un
protocole de quantification standardisé pour toutes les espèces de CMA demeure un
objectif complexe, qui demande de nouvelles études in vivo. / Arbuscular Mycorrhizal Fungi (AMF) are able to form symbiosis with approximately
80% of plant species, including most important corps. This symbiosis is known as
Arbuscular Mycorrhiza which has been largely used in agriculture to promote plant
growth by enhancing minerals uptake and protecting plants against biotic and abiotic
stresses. Despite the ecological and economical importance of this symbiosis, specific markers
for spore quantification of commercial AMF strains by quantitative real-time PCR (qPCR) are
extremely limited and none has been rigorously validated for quality control of manufactured
products such as biofertilizers. Most of the existing AMF markers developed either for
AMF identification or for AMF quantification purposes are based on either
morphological characters, on Fatty Acids Methyl Esters (FAME) profiles, on specific
isozymes or antibodies, or on nuclear DNA.
It has been shown that mitochondrial (mt) genomes are conserved among AMF species.
This allowed us to use mt genomes in order to develop efficient isolate-specfic markers.
Using the alignments of 11 complete AMF mt genomes, a qPCR assay using a hydrolysis
probes designed in the single copy cox3-rnl intergenic region was tested and validated to
specifically and accurately quantify the spores of the model R. irregularis isolate
DAOM197198 and another probe was designed in nad1-cox2 intergene specific to
Glomus cerebriforme. The specificity tests performed, using standard PCR and qPCR,
clearly showed that the primers specifically amplified the isolate DAOM-197198 or
Glomus cerebriforme DAOM220722. Quantification assays were successfully undertaken
on unknown samples in liquid suspensions, commercial solid formulations and soil
samples to show the accuracy and reproducibility of the assays. This study provides a
powerful molecular toolkit specifically designed to quantify spores of the model AMF
isolate Glomus cerebriforme DAOM220722. The latter could be applied to other AMF
taxa and will be useful to research institutions and governmental and industrial
laboratories running routine quality control of AMF-based products.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/12600 |
| Date | 04 1900 |
| Creators | Berthiaume, Stéphanie |
| Contributors | Hijri, Mohamed |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation |
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