Titre de l'écran-titre (visionné le 2 octobre 2023) / Le soya (Glycine max [L.] Merr.) est une culture de plusieurs milliards de dollars principalement utilisée pour l'industrie de l'élevage, l'alimentation humaine et aussi le biocarburant. Le Canada se classe au quatrième rang en termes de superficie, et cette dernière augmente chaque année. Avec l'augmentation de la superficie cultivée, les problèmes de ravageurs et de maladies ont également augmenté. Le pourridié phytophthoréen (PRR) est l'une des maladies les plus importantes du soya. L'oomycète Phytophthora sojae est l'agent pathogène responsable du PRR et représente chaque année un milliard de dollars de pertes pour l'industrie nord-américaine du soya. Ce pathogène attaque la plante à tous ses stades de croissance, entraînant souvent le besoin de semer de nouveau et même la perte complète de la récolte. Le moyen le plus efficace de réduire les pertes économiques causées par le PRR est d'utiliser des cultivars résistants à P. sojae. Ces cultivars possèdent des gènes de résistance (Rps) et, jusqu'à ce jour, 33 gènes Rps ont été répertoriés grâce à l'utilisation de marqueurs génétiques. Toutefois, seul le gène Rps11 a été cloné et identifié. Récemment, notre laboratoire a identifié des gènes candidat qui seraient possiblement des gènes Rps. Pour confirmer la fonction de ces gènes, il faut être en mesure de les exprimer par une plante sensible via la transformation génétique. Différentes méthodes telles que la transformation médiée par Agrobacterium ou la transformation biolistique génèrent des plants de soya génétiquement modifiés à partir de cals ou d'autres explants. Pourtant, ces techniques demandent beaucoup de main-d'œuvre et de temps, avec un faible taux d'efficacité. Lors de l'étude des gènes exprimés dans les systèmes racinaires, la technique de transformation par Rhizobium rhizogenes est idéale. Cet organisme, par le transfert d'un ADN aux cellules de la plante, cause une prolifération de fines racines « hairy root ». Cette méthode de transformation génétique a été régulièrement appliquée pour étudier la biologie des racines ou bien pour la production de métabolites secondaires, mais rarement pour étudier les interactions hôte-pathogène. Dans ce travail, la technique de transformation hairy-root a été optimisée pour caractériser la fonctionnalité des gènes candidats Rps contre P. sojae par des essais biologiques dans des systèmes hydroponiques. Dans un premier temps, nous avons testé plusieurs souches de Rhizobium rhizogenes et différentes méthodes d'inoculation pour optimiser le procédé qui donnerait le nombre maximum de racines transformées. En tant que gène rapporteur, RUBY a été sélectionné pour ses propriétés non destructives et son expression facilement identifiable dans les racines transformées. Afin d'optimiser la cassette d'expression pour les gènes candidat, la fonction de six promoteurs de soya a également été validée. Cinq promoteurs sur six ont présenté une expression du gène rapporteur dsRed2 supérieure au promoteur le plus couramment utilisé soit le CaMV35S. Pour les besoins de ces travaux, le promoteur du gène de l'ubiquitine a été choisi pour la conception de la cassette d'expression servant à héberger les gènes candidat Rps. À la suite de l'expression de ces gènes candidats dans les racines transformées, il devenait alors possible de tester la fonction de ces derniers par bioessai hydroponique. / Soybean (Glycine max [L.] Merr.) is a multi-billion-dollar crop primarily used to produce animal feed, food, and fuel. Soybean ranks fourth in terms of area, and the area under its cultivation is increasing every year. With the increase in cultivated areas, pest and disease problems have also increased. Phytophthora root rot (PRR) is one of the most important diseases of soybeans. The oomycete Phytophthora sojae is the pathogen responsible for the disease and accounts forbillion in losses annually for the North American soybean industry. This pathogen attacks the plant at all stages of growth, often leading to replanting or complete loss of the crop. The most effective way to reduce the economic losses caused by PRR is to use cultivars resistant to P. sojae (Rps) genes. Approximately 33 Rps genes has been identified. Many of these 33 Rps genes are linked to genetic markers, but only Rps11 has been identified and cloned. Our laboratory has identified putative sequences of Rps genes, and the functional characterization of these sequences must go through the transformation of soybeans. Different methods, such as Agrobacterium-mediated transformation or biolistic transformation, generate genetically modified soybean plants from callus or other explants. Yet, these techniques are labor-intensive and time-consuming, with a low efficiency rate. When studying genes expressed in root systems, the Rhizobium rhizogenes-mediated hairy root transformation technique is ideal. Hairy root transformation has been regularly applied to study root biology or secondary metabolite production, but rarely to study host-pathogen interactions. In this work, the hairy root transformation technique was optimized to characterize the functionality of candidate Rps genes against P. sojae by bioassays in hydroponic systems. First, we tested several strains of Rhizobium rhizogenes and different inoculation methods to identify the procedure that would yield the maximum number of transformed roots. As a reporter gene, RUBY was selected for its non-destructive properties and easily identified expression in transformed roots. We also validated the function of six soybean promoters using the optimized hairy root transformation system. Five of six promoters expressed the dsRed2 reporter gene better than the positive control CaMV35S promoter. Finally, the best promoter was used to design an expression cassette for candidate Rps gene from previously identified sequences, which can be used for functional characterization by hydroponic phenotyping. In conclusion, this optimized hairy root transformation will provide a rapid and reliable method to validate the function of putative Rps genes in the soybean- P. sojae interaction.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/126164 |
| Date | 20 October 2023 |
| Creators | Parthasarathy, Sangeeta |
| Contributors | Bélanger, Richard R. (Richard Robert) |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | COAR1_1::Texte::Thèse::Mémoire de maîtrise |
| Format | 1 ressource en ligne (xi, 50 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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