La Recombinaison Homologue (RH) est une des voies majeures, hautement fidèle, de réparation des cassures double brin de l’ADN et du redémarrage des fourches de réplication arrêtées ou bloquées. La RH utilise une séquence homologue pour réparer avec précision l'ADN. Elle est essentielle pour le maintien de la stabilité des génomes dans tous les organismes et également pour assurer la transmission et l'échange de l'information génétique pendant la méiose. L'étude mécanistique de la RH est importante pour comprendre l'instabilité génétique, la perte d'hétérozygotie, les aberrations chromosomiques, la mort cellulaire et la cancérogenèse associée à une RH déficiente. Les étapes clés de la RH et les protéines impliquées sont très conservées dans toutes les espèces. Chez Saccharomyces cerevisiae, la recombinase Rad51 forme un filament présynaptique avec l’ADNsb qui est capable de rechercher les homologies de séquences dans tout le génome, en partenariat avec d'autres partenaires protéiques. Une fois l'homologie identifiée, une structure de D-loop (pour Displacement loop) est formée pour favoriser l'échange de brins. Le moteur moléculaire Rad54 assiste Rad51 dans la formation de la D-loop. Son rôle dans la recherche d'homologie et la formation des complexes synaptiques, avant mêle la formation de la D-loop reste un sujet de débat. Cette thèse porte sur mes travaux d’étude in vitro des mécanismes de formation de la D-Loop, en utilisant des protéines de la RH purifiées Rad51 et Rad54 avec d'autres partenaires protéiques et des substrats d'ADN synthétisés, mimant les structures de la RH. J'ai utilisé la microscopie électronique (ME) pour visualiser directement l'ADN et les complexes ADN-protéines intervenant au cours de la formation de D-loop in vitro avec Rad51, Rad54 et un mutant de Rad54. Ces approches d’imagerie, combinées à la biochimie suggèrent que Rad54 est crucial pour la recherche d'homologie et la formation du complexe synaptique, avant la formation de la D-loop, dans une coopération étroite avec Rad51. J'ai également montré que les paralogues de Rad51, Rad55-Rad57, stimulent la formation de la D-loop et que cet hétérodimère présente une activité ATPase dix fois plus forte que Rad51. Par ailleurs, j'ai également développé d'autres outils méthodologiques en ME et en microscopie à force atomique à haute vitesse (HS-AFM) pour mieux caractériser différents intermédiaires de la RH. / Homologous recombination (HR) is a major high-fidelity DNA repair pathway of double-stranded breaks and recovery of stalled and collapsed replication forks. HR uses a homologous template to accurately repair DNA that is essential for maintaining genomic stability in all organisms and to ensure the transmission and exchange of the genetic information during meiosis. The importance of HR study is highlighted by genetic instability, loss of heterozygosity, chromosomal aberrations, cell death and carcinogenesis associated with a defected HR. The key recombinational stages and proteins are well conserved throughout species. In Saccharomyces cerevisiae, the Rad51 recombinase forms a presynaptic filament with ssDNA that along with other protein partners is able to search for homology within the entire genome. Once homology is identified, a Displacement-loop (D-loop) is formed to promote strand-exchange. The Rad54 molecular motor assists Rad51 in the D-loop formation, and it is still a matter of debate whether it also plays a key role in homology search and synaptic complex formation, prior to D-loop. This dissertation covers my in vitro assays using purified key HR proteins Rad51 and Rad54, other protein partners and designed DNA substrates, mimicking HR structures.I used electron microscopy (EM) to directly visualize the HR DNA and DNA-protein complexes generated by D-loop in vitro assay with Rad51, Rad54 and a Rad54 mutant, and these studies combined with biochemistry suggest Rad54 is crucial to homology search and synaptic complex formation, prior to D-loop formation, in a tight intercooperation by Rad51 and Rad54. In a multiprotein system, I also showed the Rad51 paralogs Rad55-Rad57 stimulate the D-loop formation and that this heterodimer presents a ten times stronger ATPase activity than Rad51. I also developed other EM and high speed atomic force microscopy (HS-AFM) methodological tools to characterize other HR intermediates.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2018SACLS306 |
| Date | 02 October 2018 |
| Creators | Moreira Tavares, Eliana |
| Contributors | Université Paris-Saclay (ComUE), Le Cam, Eric |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image |
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