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Previous issue date: 2016-07-28 / Facepe / A L-asparaginase (E.C. 3.5.1.1) é essencial para um curso normal do ciclo celular, estando presente em bactérias, fungos, animais e plantas e não é encontrada em seres humanos. Importante para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda dentre outras doenças leucêmicas e a doença de Hodgkin. As Pseudomonas são ocorrentes no solo e água, apresentam a capacidade de produzir enzimas, como é o caso da L-asparaginase do Tipo I e II. Com isso, o objetivo deste trabalho foi obter melhores parâmetros para otimização, purificação parcialmente da L-asparaginase excretada por Pseudomonas sp. isolada da rizosfera da Caesalpinia. pyramidalis. No presente estudo visando otimizar a produção do complexo de L-asparaginase foi realizado um planejamento experimental central composto (23) com 4 pontos centrais, sendo as variáveis pH (4, 7 e 10), temperatura (30°C, 40°C e 50°C) e concentração da L-asparagina (0,2%, 0,5% e 0,8%) estudadas. Posteriormente realizou-se a análise estatística das variáveis e a análise da variância (ANOVA) dos resultados obtidos que foram avaliados através do programa Statistica, versão 7.0 (StatSoft Co., USA). Em seguida, realizou-se a purificação da enzima L-asparaginase excretada por Pseudomonas sp. através da técnica de cromatografia de troca iônica e uma eletroforese SDS-PAGE. Posteriormente, foi realizada a caracterização da enzima purificada, avaliando os efeito e estabilidades em diferentes valores de pH e temperaturas, por fim a enzima em diferentes substratos e íons. Finalizando foram efetuadas as identificações morfológica e molecular da bactéria, utilizando o Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) e a nível de espécie usou-se o primer 16 S respectivamente. Os resultados obtidos no procedimento de otimização da atividade de L-asparaginase foram obtidos nos ensaios com concentração de L-asparagina a 0,8%, pH 4 e temperatura de 30°C, com valores de atividades 0,5604 U/mL e 0,0632 mg de proteína/mL, respectivamente. Os melhores dados da cromatografia de troca iônica mostraram que das 57 frações coletadas, as de melhor atividade para L-asparaginase, foram as frações de valores 1,1412 U/mL e 1,1417 U/mL, com um rendimento de 0,64% e 18,6 U/mg de atividade específica. Realizou-se uma eletroforese PAGE-SDS para obter o peso molecular da proteína, apresentando como peso molecular de 32 kDa. Na caracterização enzimática, a enzima se mantem estável em pH 7, em relação a temperatura, tivemos a melhor estabilidade 30 °C, a L-asparaginase apresentou melhor efeito nos substratos L-asparagina seguido da L-glutamina e por fim o nitrato de sódio (NaNO3), cloreto de Mercúrio (HgCl2), cloreto de magnésio (MgCl2) e ureia apresentaram os melhores efeitos de íons. Em relação à identificação bacteriana encontrou-se colônias em forma de bastonetes curtos, com longos flagelos e a nível de espécie foi denominada com sendo Pseudomonas aeruginosa. Portanto, os resultados obtidos da L-asparaginase caracterizada, isolada da P. aeruginosa, mostraram resultados significativos e extremamente importantes para a indústria biotecnológica, apresentando assim a viabilidade e confiabilidade do estudo realizado. / L-asparaginase (E.C. 3.5.1.1) is essential for the normal course of cell cycle being present in bacteria, fungi, animals and plants and is not found in humans. Important for the treatment of acute lymphoblastic leukemia among other leukemic disease and Hodgkin's disease. The Pseudomonas are occurring in soil and water, have the capacity to produce enzymes, such as L-asparaginase Type I and II. Thus, the aim of this study was to obtain the best parameters for optimization, purification part of L-asparaginase secreted by Pseudomonas sp. isolated from the rhizosphere of Caesalpinia pyramidalis. In the present study to optimize the production of L-asparaginase complex was performed a central experimental design compound (23) with four central points and the variables pH (4, 7 and 10), temperature (30°C, 40°C and 50°C) and concentration of L-asparagine (0,2%, 0,5% and 0,8%) studied. Later there was the statistical analysis of the variables and analysis of variance (ANOVA) of the results that were evaluated through Statistica, version 7.0 (StatSoft Co., USA). Then there was the purification of L-asparaginase enzyme secreted by Pseudomonas sp. by ion exchange chromatography technique and SDS-PAGE electrophoresis. Afterwards, the characterization of the purified enzyme was carried out to evaluate the effect and stability at different pH values and temperatures, and finally the enzyme on different substrates and ions. Finalizing were made the morphological and molecular identification of bacteria using the Scanning Electron Microscope (SEM) and the kind of level we used the primer 16S respectively. The results of the optimization procedure for L-asparaginase activity in the assays were obtained with a concentration of L-asparagine to 0,8%, pH 4 and 30°C, with activity values 0,5604 U/mL and 0,0632 mg of protein/mL, respectively. The best data ionic exchange chromatography showed that the 57 collected fractions, the best activity to L-asparaginase were fractions values 1,1412 U/mL and 1,1417 U/mL, with a yield of 0,64 % and 18,6 U/mg specific activity. We performed a SDS-PAGE electrophoresis for the molecular weight of the protein, presenting as molecular weight of 32 kDa. In the enzyme characterization, the enzyme is stable at pH 7 with respect to temperature had better 30 °C stability, L-asparaginase had a better effect on the L-asparagine substrate followed by L-glutamine and finally sodium nitrate (NaNO3), mercury chloride (HgCl2), magnesium chloride (MgCl2) and urea showed the best effects ions. Regarding the bacterial identification met colonies in the form of short rods with flagella long and species level was named as being Pseudomonas aeruginosa. Therefore, the results of characterized L-asparaginase, isolated from P. aeruginosa, showed significant results and extremely important for the biotechnology industry, thus presenting the viability and reliability of the study performed.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/18528 |
| Date | 28 July 2016 |
| Creators | SILVA, Iasmim Lucas da |
| Contributors | http://lattes.cnpq.br/2944428818449047, COELHO, Luana Cassandra Breitenbach Barroso, SILVA, Leonor Alves de Oliveira da |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco, Programa de Pos Graduacao em Ciencias Biologicas, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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