Haemophilus influenzae (Hi) é uma bactéria Gram-negativa comensal da nasofaringe e um patógeno oportunista cujo único hospedeiro natural conhecido é o ser humano. As cepas de Hi que possuem cápsula de polissacarídeo estão associadas a doenças invasivas mais graves, sendo as de sorotipo b (Hib) as principais causadoras da meningite bacteriana em populações não vacinadas. Para produzir a vacina contra Hib, o polissacarídeo purificado desta bactéria é conjugado quimicamente ao toxóide tetânico. Industrialmente, a produção do polissacarídeo é realizada cultivando esse micro-organismo em biorreatores, entretanto o rendimento em polissacarídeo é baixo, mesmo com fornecimento de nutrientes, controle de pH e outros ajustes das condições no decorrer do cultivo. O estudo dos diferentes perfis fisiológicos da população bacteriana de Hib no decorrer do cultivo através da transcritômica traz a possibilidade de aprofundar o conhecimento sobre o metabolismo desse micro- organismo. As taxas de transcrição dos genes expressos em diferentes momentos considerados como pontos metabolicamente significativos do cultivo de Hib linhagem GB 3291 em batelada alimentada conduzido em Biorreator de 10 L, com aeração submersa e controles de pH (7,0) e temperatura (30° C) foram obtidas através de sequenciamento de RNA paralelo massivo (RNA-seq). A análise de co-expressão dos genes foi realizada com WGCNA, em que oito módulos de genes co-expressos foram identificados, quatro dos quais apresentaram correlação alta com dados fenotípicos dos cultivos, inclusive produtividade de acetato e de polissacarídeo. Análise de enriquecimento funcional identificou vias metabólicas associadas a ribossomo, síntese de parede celular, transportadores e consumo de carbono. A análise de expressão diferencial permitiu observar o comportamento desta bactéria durante o cultivo. Através da análise das taxas de transcrição dos genes foi possível identificar as principais vias de síntese de acetato e de polissacarídeo capsular, sendo esta última feita principalmente através da via de pentose fosfato, em detrimento da via de interconversão pentose-glucuronato. Nossos dados mostram que as diferentes etapas do cultivo de Hib leva à ação conjunta de vários grupos de genes, com destaque àqueles ligados às funções celulares básicas, como a síntese de proteínas e de parede celular, o transporte e a síntese de aminoácidos. Esses resultados contribuem para o entendimento dos processos bioquímicos e celulares que ocorrem durante o processo de cultivo de Hib, possibilitando que sejam feitas sugestões de modificações genéticas em Hib e alteração no processo de cultivo com propósito de diminuir produção de acetato e aumentar produção do polissacarídeo. / Haemophilus influenzae (Hi) is a nasopharynx commensal Gram-negative bacterium and an opportunistic pathogen whose only known natural host is human being. Hi strains with polysaccharide capsule are related to more severe invasive diseases, wherein type b capsule (Hib) strains are the main cause of bacterial meningitis in unvaccinated population. To produce Hib vaccine, purified polysaccharide of this bacterium is chemically conjugated to tetanus toxoid protein. Industrially, polysaccharide production is performed by cultivating this micro-organism in bioreactors; however, the yield of polysaccharide is low, even with supply of nutrients, pH control and further adjustments of the fermentation conditions during cultivation. The study of different physiological profiles of Hib bacterial population during cultivation by transcriptomics brings the possibility to deepen the knowledge about the metabolism of this micro-organism. Transcription of genes expressed at different times considered metabolically significant points of Hib strain GB 3291 grown in fed-batch conducted in a 10 L bioreactor with submerged aeration and pH (7.0) and temperature (30 ° C) control rates were obtained through massive parallel RNA sequencing (RNA-seq). Gene co-expression analysis was performed with WGCNA, in which eight modules of co-expressed genes were identified, four of which showed high correlation with cultivation data traits, including acetate and polysaccharide productivity. Enrichment analysis identified pathways related to ribosome, cell wall synthesis, transports and carbon consumption. Differential expression analysis allowed to observe this bacteria behaviour during cultivation. Through transcription rate analysis, it was possible to identify the main pathways for acetate and polysaccharide synthesis, which is through pentose phosphate pathway instead of glucoronate-pentose pathway. Our data show that different stages in Hib cultivation leads to joint action of several gene groups, highlighting genes related to basic cellular roles, like protein and cell wall synthesis, transport and aminoacid synthesis. These results contribute to the understanding of biochemical and cellular processes that ocurr during Hib cultivation process, allowing suggestions to be made to modify Hib gene circuitry and to change cultivation process in order to decrease acetate production and to decrease acetate production and increase polysaccharide production.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-16032018-144403 |
| Date | 24 November 2017 |
| Creators | Carlos Eduardo Madureira Trufen |
| Contributors | Anatoli Iambartsev, Enéas de Carvalho, Julia Maria Pavan Soler, Flavia Vischi Winck |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Bioinformática, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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