Nous avons utilisé des anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine T du complexe de la glycine décarboxylase (GDC) pour isoler un ADNc de 1430 pb codant pour la protéine T de pois. L'analyse de la séquence nucléotidique a montré que la protéine T était synthétisée sous forme d'un précurseur comportant un peptide de transit mitochondriale de 30 aminoacides précédant la protéine T mature qui comporte 378 aminoacides. La masse déduite de la séquence primaire est de 40 961 Da et correspond exactement à la valeur mesurée au spectromètre de masse, ce qui indique que le cofacteur de la protéine T, le tétrahydrofolate n'est pas fixé de manière covalente sur la protéine. La structure primaire de la protéine T a pu également être confirmée par analyse en HPLC-ESI/MS et par microséquençage des fragments générés par protéolyse chimique de la protéine T purifiée. Des homologies de séquences avec les protéines T de foie de poulet, de boeuf et de pomme de terre, nous ont permis de localiser des régions hautement conservées comportant des résidus chargés positivement qui pourrait être impliquées dans les intéractions avec le tétrahydrofolate. L'étude de l'expression de la protéine T par Northern et Western-blot a montré que la protéine T et les messagers correspondants était principalement présents dans les tissus foliaires et subissaient une forte induction (8 à 10 fois) à la lumière. Disposant de tous les outils moléculaires nécessaires à l'étude de la biogénèse de la GDC, nous avons étudié les modalités de mise en place du complexe au cours du développement de la feuille de pois. Nous avons observé que la capacité d'oxydation des mitochondries de tissus foliaires durant les premiers stades était négligeable pour augmenter de façon dramatique lorsque la feuille était pleinement ouverte (9 jours). En effet, contrairement à la Rubisco qui est présente dans les chloroplastes dès les tout premiers stades du développement, les protéines de la GDC se mettent en place beaucoup plus tardivement au sein de la matrice mitochondriale. Ce chargement en GDC des mitochondries est tellement important qu'il se traduit par une augmentation de leur densité. L'analyse des transcrits des gènes codant pour les protéines de la GDC (P, H et T) et la petite sous unité de la Rubisco révèle qu'ils sont exprimés dès le 4ième jour de croissance, stade où les mitochondries sont incapables d'oxyder la glycine. Cela suggère l'existence d'un contrôle post-transcriptionnel de l'expression des gènes codant pour les protéines P, H et T de la GDC. Nous avons isolé le gène codant pour la protéine T qui est composé de 4 exons et dont la taille approximative est de 3 kpb. Nous avons détecté deux démarrages de transcription dont l'un présente une séquence riche en pyrimidine proche de la séquence Inr (Initiator element). L'analyse de la région promotrice du gène révèle essentiellement trois régions consensus, découvertes chez les gènes nucléaires codant pour la petite sous-unité de la Rubisco et pour la protéine liant les chlorophylles a/b : une région riche en nucléotide AT, un motif GATA en tandem et la boîte II (GGTTAA). Ces séquences semblent être impliquées dans la réponse à la lumière et dans la spécificité tissulaire. L'incubation de la région riche en nucléotides AT et de la boîte II avec un extrait nucléaire provenant de feuilles vertes a permis de caractériser certains facteurs de transcription similaires à ceux présents chez rbcS3,6 et rbcS3A. Dans la perspective de l'étude structurale de la protéine T, nous avons réussi à surexprimer chez E. coli la protéine T, seule ou en tandem avec la protéine H. La présence de nombreux codons rares dans la séquence nucléotidique, nous a amené à construire des vecteurs coexprimant l'ARNt codant pour l'arginine, de façon à permettre la traduction de la protéine dans la bactérie.
Identifer | oai:union.ndltd.org:CCSD/oai:tel.archives-ouvertes.fr:tel-01011285 |
Date | 29 March 1996 |
Creators | Vauclare, Pierre |
Source Sets | CCSD theses-EN-ligne, France |
Language | fra |
Detected Language | French |
Type | PhD thesis |
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