Alors que les étapes du cycle du virus de la rage sont plutôt bien décrites, les interactions du virus avec la machinerie cellulaire restent mal connues. Le but de ce projet de thèse a été d’identifier et caractériser les voies de signalisation cellulaires impliquées dans le déroulement du cycle viral. Les kinases cellulaires jouent un rôle majeur dans la régulation de ces voies et certaines protéines rabiques ont déjà été décrites comme cibles de ces enzymes. Afin d’identifier les kinases impliquées dans le déroulement du cycle viral, nous avons réalisé un criblage d’une banque d’inhibiteur de kinases. L’analyse a été effectuée par cytométrie en flux dans des cellules infectées avec un virus rabique recombinant exprimant la protéine fluorescente GFP. Nous avons ainsi pu isoler deux inhibiteurs de kinases bloquant l’infection : La Tyrphostin 9,un inhibiteur de l’autophosphorylation du récepteur au PDGF (platelet-derived growth factor) (PDGF.R), et la Rottlerin, un inhibiteur de la PKCδ et découplant mitochondrial. Nous avons confirmé leur activité anti-virale dans différents types cellulaires (fibroblaste, glioblastome,neuroblastome et neurones primaires) et sur deux souches rabiques (CVS et SAD-B19). Par diverses approches expérimentales, nous avons identifié l’étape du cycle viral ciblée par chacun de ces inhibiteurs. Les résultats obtenus montrent que la Tyrphostin 9 perturbe une étape très précoce de l’infection : la fusion virale et plus particulièrement l’acidification endosomale. Nous avons observé que la Tyrphostin 9 provoquait également une désagrégation de l’appareil de Golgi. L’inhibition de l’acidification endosomale pourrait donc découler de cet effet. En présence de Rottlerin, le cycle viral est également inhibé au niveau d’une étape précoce : la réplication. A l’aide de siRNA, nous avons montré que cet effet de la Rottlerin est indépendant de la PKCδ. Les expériences réalisées avec un découplant mitochondrial bien caractérisé, le CCCP, tendent à montrer que l’effet de la Rottlerin est dû à sa fonction de découplant mitochondrial, qui induit une diminution du niveau d’ATP intracellulaire. Ce travail a permis d’identifier deux inhibiteurs de kinases inhibant des étapes précoces du cycle rabique. Les cibles cellulaires précisément impactées ainsi que l’effet sur le fonctionnement cellulaire lors de l’infection virale restent à déterminer. Des études in vivo pourraient valider leur utilisation en tant qu’agents antiviraux. / However the rabies viral cycle is fairly well described, the interactions with the cellular machinery are not. This thesis project aimed at identifying and characterizing the cellular signaling pathways involved in the establishment and progress of the viral cycle through the study of cellular kinases. Indeed, kinases are the main actors of these pathways and their effects on certain rabies proteins have already been reported. In order to identify kinases involved in the viral cycle, we screened a kinase inhibitor library for anti-viral activity using a recombinant rabies virus expressing the GFP fluorescent protein. This assay allowed us to isolate two kinase inhibitors that block rabies virus infection: Tyrphostin 9, an inhibitor of the receptor tyrosine kinase platelet-derived growth factor receptor (PDGF.R), and Rottlerin, a PKCδ inhibitor and mitochondrial uncoupler. We confirmed their anti-viral action in different cell types (fibroblast, glioblastoma, neuroblastoma, as well as primary neurons) and on different rabies strains (CVS and SAD-B19). Using various experimental approaches, we found that each inhibitor impairs an early stage of the viral cycle: the viral fusion and more specifically the endosomal acidification by Tyrphostin 9 and the viral replication step by Rottlerin. We observed that Tyrphostin 9 also caused disintegration of the Golgi apparatus. The inhibition of endosomal acidification could therefore result from this effect. Seeking for the mechanisms involved in Rottlerin’s effect, we evidenced that it is independent of PKCδ. Experiments with a well characterized mitochondrial uncoupler (CCCP), revealed that the Rottlerin anti-viral effect is rather due to its mitochondrial uncoupling function, which leads to a decrease of the cellular ATP level. This study allowed the identification of two kinase inhibitors with anti-viral effects acting on early stages of the rabies cycle. The cellular targets as well as the effect on the cellular functions during viral infection remain to be determined. In vivo studies could validate their use in therapeutics as anti-rabies agents.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2017SACLS490 |
| Date | 11 December 2017 |
| Creators | Lama, Zoé |
| Contributors | Université Paris-Saclay (ComUE), Blondel-Maingonnat, Danielle, Lagaudrière, Cécile |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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