La dilution isotopique, SID pour « Stable Isotope Dilution », est une méthode largement utilisée pour la quantification de peptides et protéines en spectrométrie de masse, généralement associée aux techniques d’ionisation ambiante. Les travaux de cette thèse sont donc consacrés à l’application de la méthodologie de la dilution isotopique (SID) en spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par une matrice (MALDI) pour la mesure d’interaction récepteur/ligand en pharmacologie. En effet, un nombre important de pathologies mettent en jeu des récepteurs membranaires tels que les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) en interaction avec différents ligands, souvent peptidiques. En particulier, le récepteur V1A est impliqué dans l’activité vasoconstrictrice de l’hormone peptidique AVP (Arginine VasoPressine) et la contraction de cellules musculaires ainsi que dans certains comportements sociaux. Ce récepteur a été choisi comme modèle d’étude nécessitant le marquage par voie chimique du ligand Homo-HO-LVA (pour « Hydroxy Linear Vasopressin Antagonist »), sélectionné pour sa forte affinité envers le récepteur V1A afin d’introduire l’entité permettant le dosage en SID/MALDI. Cette méthodologie est mise en œuvre via la génération d’une liaison covalente de la matrice HCCA (4-hydroxy-α-cyanocinnamic acid), couramment utilisée pour l’analyse peptidique pour obtenir le peptide modifié (JMV4854) par acylation en position N-terminale. Le but est alors de tirer profit de l’utilisation conjointe de ce marquage et de la matrice neutre HCCE (4-hydroxy-α-cyanocinnamate de méthyle) pour la détection spécifique et sensible de composés jusqu’à des concentrations picomolaires. L’étape stratégique de quantification par dilution isotopique nécessite un étalonnage et une validation statistique avant de pouvoir passer à l’application pharmacologique. Celle-ci consiste à mesurer l’affinité du JMV4854 pour le récepteur V1A par des expériences thermodynamiques de mesure de constantes de dissociation (Kd) afin de déterminer par la suite des constantes de dissociation de molécules non marquées via des expériences de compétition. Un second modèle de récepteur, le CCKB-R (cholecystokinine B receptor), a ensuite été étudié pour valider la méthodologie de quantification. Devant le regain d’intérêt des laboratoires pharmaceutiques pour les expériences cinétiques de mesure de constantes de dissociation, il serait intéressant d’y appliquer cette méthodologie. Celle-ci présente un potentiel intéressant en tant qu’alternative aux méthodologies actuellement incontournables que sont la radioactivité et la fluorescence. Un second d’axe d’étude a été initié avec un marquage conçu pour diriger la fragmentation de peptides pour des mesures en spectrométrie de masse en tandem par ionisation Electrospray (ESI-MS/MS). Des modifications par introduction en position N-terminale des peptides d’une charge fixe ont été envisagées. Des études préliminaires (synthèse d’ions préformés par incorporation d’une entité pyridinium) ont montré un comportement prometteur en fragmentation ouvrant de nouvelles perspectives de quantification. / The SID methodology, for Stable Isotope Dilution, is a widely applied methodology for peptides and proteins analysis in mass spectrometry, usually associated with atmospheric pressure ionisation techniques. This thesis is consequently devoted to the application of SID methodology in matrix assisted laser desorption/ionisation (MALDI) mass spectrometry to quantify receptor/ligand interaction in pharmacology. Indeed, a great number of pathologies involve membrane receptors like G protein coupled receptors (GPCR) in interaction with several ligands, frequently peptides. Particularly, the V1A receptor, is related to vasoconstriction activity of the peptide hormone AVP (arginine vasopressine) and contraction of muscular cells as well as many social behaviors. This receptor was chosen as model, requiring the chemical labelling of the ligand Homo-HO-LVA (Hydroxy Linear Vasopressin Antagonist), selected for its high affinity towards the V1A receptor in order to introduce the entity on which relies the quantification in SID/MALDI. This methodology is applied through the covalent binding of HCCA (4-hydroxy-α-cyanocinnamic acid) matrix, usually encountered in peptide analysis, to obtain the modified peptide (JMV4854) through N-terminal acylation. The objective is to take advantage of the use of both HCCA tagging and HCCE (4-hydroxy-α-cinnamic methyl ester) matrix for the specific and sensitive detection of compounds down to picomolar concentrations. Importantly, quantification with SID requires a calibration protocol and a statistical validation before pharmacological assays. This consists in the measurement of JMV4854 affinity towards V1A-R through thermodynamic experiments in order to quantify the dissociation constant (Kd) and determine afterwards constants for untagged molecules by competitive binding assays. Furthermore, a second receptor model, CCKB-R (cholecystokinine B receptor), was then studied to validate the quantification methodology. Facing the renewed interest in pharmaceutic industry of kinetic experiments for dissociation constant measurement, it would be interesting to apply this new methodology to drug discovery, representing a relevant alternative to current “gold-standard” methodologies such as radioactivity and fluorescence. A second field of research has been initiated with a covalent labelling designed to enhance peptide fragmentation for electrospray-based (ESI-MS/MS) tandem mass spectrometry measurements. Preliminary studies with the synthesis of pre-formed ions like N-terminal substitution with pyridinium entities gave very promising results opening the way of other quantification strategies.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2016MONTS007 |
| Date | 04 November 2016 |
| Creators | Rossato, Maxime |
| Contributors | Montpellier, Enjalbal, Christine |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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