Modificações epigenéticas tais como metilação do DNA, constituem um mecanismo especial de regulação da expressão gênica envolvido em muitas situações patológicas. Padrões alterados de metilação do DNA são comuns em cânceres e infecções virais. A Paracoccidioidomicose (PCM) é uma infecção fúngica sistêmica, causada pelo fungo termo-dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. O Brasil é detentor do maior número de casos na América do Sul. A doença apresenta envolvimento pulmonar primário com disseminação para mucosa oral, pele, sistema retículo-endotelial e glândulas suprarrenais. As lesões orais são caracterizadas por hiperplasia eritematosa finamente granular, salpicadas com hemorragias pontuais chamadas de estomatite moriforme. A finalidade deste estudo foi identificar perfis diferenciais de metilação do DNA em pacientes com e sem lesão oral na PCM. A identificação destes perfis foi baseada na estratégia de MS-AP-PCR (Amplificação arbitrária sensível a metilação). O DNA, extraído do sangue total de pacientes com e sem lesão oral, foi digerido com as enzimas de restrição Hpa II e Msp I. Os produtos da digestão foram amplificados pela técnica de PCR, utilizando iniciadores arbitrários. Foi obtido um perfil diferencial de metilação após a amplificação do DNA de pacientes sem lesão de boca, comparado ao perfil de pacientes com lesão de boca. A banda diferencialmente expressa foi purificada, clonada e os plasmídeos obtidos P5, P6 e P7 foram analisados pelo software PhredPhrap e na ferramenta BLASTN para a obtenção de dados de mapeamento e identidade com as sequências presentes no genoma humano. O fragmento clonado no plasmídeo P5 apresentou similaridade com uma sequência de DNA presente no cromossomo 20, próxima ao gene YTHDF1. Os fragmentos clonados nos plasmídeos P6 e P7 apresentaram similaridade com sequências de DNA presentes no cromossomo 15, sendo que o fragmento P6 apresentou similaridade com uma sequência intrônica do gene RNA binding protein with multiple splicing 2” (RBPMS2) e o fragmento P7 com uma sequência intrônica do gene “diphthamine biosynthesis 6” (DPH6)”. A expressão do gene YTHDF1 em leucócitos foi testada por PCR em tempo real e não houve diferença significativa nos dois grupos de pacientes. Ainda não há descrição na literatura da correlação do gene YTHDF1 com a PCM tornando este estudo inédito e mostrando a importância da análise epigenética para conhecimento dos mecanismos celulares nas condições normais e também patológicas. / Epigenetic changes such as DNA methylation is a specific mechanism for the regulation of gene expression involved in many pathological situations. Altered patterns of DNA methylation are common in cancers and viral infections. Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic fungal infection caused by a thermo-dimorphic fungus, Paracoccidioides brasiliensis. Brazil is having the largest number of cases in South America. The disease presents primary pulmonary involvement that spreads to oral mucus, skin, reticuloendothelial system, and adrenals. Oral lesions are characterized by erythematous fine granular hyperplasia, and speckled with occasional bleeding called moriform stomatitis. The purpose of this study was to identify profiles of different DNA methylation in patients with and without oral lesions in PCM. The identification of these profiles was based on the strategy of MS-AP-PCR (Methylation-Sensitive arbitrarily Primed PCR). The DNA extracted from whole blood of patients with and without oral lesions was digested with restriction enzymes: Hpa II and Msp I. The digestion products were amplified by PCR (polymerase chain reaction) using arbitrary primers. We obtained a differing profile after amplifying the DNA from patients without mouth lesions compared to the profile of patients with mouth lesions from agarose gel electrophoresis. The differently expressed band was purified and cloned, and the obtained plasmids, P5, P6 and P7, were analyzed by the softwares PhredPhrap and BLASTN tool to obtain mapping data and identify the sequences present in the human genome. The cloned fragment in the plasmid P5 showed similarity with a DNA sequence present in chromosome 20, next to the gene YTHDF1. The fragments cloned in plasmids P6 and P7 showed similarity with the DNA sequences present on chromosome 15, the P6 fragment showed similarity with an intronic sequence from the gene, “RNA binding protein with multiple splicing 2 "(RBPMS2), and the P7 fragment showed similarity with the intronic sequence of the gene "diphthamine biosynthesis 6" (DPH6) ".biosynthesis 6" (DPH6)". The YTHDF1 gene expression in leukocytes was tested by real-time PCR and no significant difference were found in both groups of patients. There is no description in the literature relating the YTHDF1 gene with PCM which has shown the importance of study epigenetic for understanding the cellular mechanisms under normal and pathological conditions.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:10.254.254.39:tede/402 |
| Date | 05 August 2014 |
| Creators | SINGI, Paola |
| Contributors | MALAQUIAS, Luiz Cosme Cotta, http://lattes.cnpq.br/7906603173916075, COELHO, Luiz Felipe Leomil, SOUZA, Paulo Eduardo Alencar de, OLIVEIRA, Jaqueline Carvalho de |
| Publisher | Universidade Federal de Alfenas, Faculdade de Odontologia, Brasil, UNIFAL-MG, Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UNIFAL, instname:Universidade Federal de Alfenas, instacron:UNIFAL |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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