Les méthodes de microscopie de super-résolution (SRM) telles que la microscopie PALM (photoactivated localization microscopy), STORM (stochastic optical reconstruction microscopy), BALM (binding-activated localization microscopy) et le DNA-PAINT, représentent un nouvel ensemble de techniques de microscopie optique qui permettent de surpasser la limite de diffraction ( > 200 nm dans le spectre visible). Ces méthodes sont basées sur la localisation de la fluorescence de molécules uniques, et peuvent atteindre des résolutions de l'ordre du nanomètres (~20 nm latéralement et 50 nm axialement). Les techniques SRM ont un large spectre d'applications dans les domaines de la biologie et de la biophysique, rendant possible l'accès à l'information tant dynamique que structurale de structures connues ou non, in vivo et in vitro. Beaucoup d'efforts ont été fournis durant la dernière décennie afin d'élargir le potentiel de ces méthodes en développant des méthodes de localisation à la fois plus précise et plus rapide, d'améliorer la photophysique des fluorophores, de développer des algorithmes pour obtenir une information quantitative et augmenter la précision de localisation, etc. Cependant, très peu de méthodes ont été développées pour examiner l'hétérogénéité des images et extraire les informations statistiquement pertinent à partir de plusieurs milliers d'images individuelles super-résolues. Dans mon travail de thèse, je me suis spécifiquement attaquée à ces limitations en: (1) construisant des objets de dimensions nanométriques et de structures bien définies, avec la possibilité d'être adaptés aux besoins. Ces objets sont basés sur les origamis d'ADN. (2) développant des approches de marquage afin d'acquérir des images homogènes de ces objets. (3) implémentant des outils statistiques dans le but d'améliorer l'analyse et la validation d'images. Ces outils se basent sur des méthodes de reconstruction de molécules uniques communément appliquées aux reconstructions d'images de microscopie électronique. J'ai spécifiquement appliqué ces développements à la reconstruction de formes 3D de deux origamis d'ADN modèles (en une et trois dimensions). Je montre comment ces méthodes permettent la dissection de l'hétérogénéité de l'échantillon, et la combinaison d'images similaires afin d'améliorer le rapport signal sur bruit. La combinaison de différentes classes moyennes ont permis la reconstruction des formes tridimensionnelles des origamis d'ADN. Particulièrement, car cette méthode utilise la projection 2D de différentes vues d'une même structure, elle permet la récupération de résolutions isotropes en trois dimensions. Des fonctions spécifiques ont été adaptées à partir de méthodologies existantes afin de quantifier la fiabilité des reconstructions et de leur résolution. A l'avenir, ces développements seront utiles pour la reconstruction 3D de tous types d'objets biologiques pouvant être observés à haute résolution par des méthodologies dérivées de PALM, STORM ou PAINT. / Super resolution microscopy (SRM) methods such as photoactivated localization microscopy (PALM), stochastic optical reconstruction microscopy (STORM), binding-activated localization microscopy (BALM) and DNA-PAINT represent a new collection of light microscopy techniques that allow to overpass the diffraction limit barrier ( > 200 nm in the visible spectrum). These methods are based on the localization of bursts of fluorescence from single fluorophores, and can reach nanometer resolutions (~20 nm in lateral and 50 nm in axial direction, respectively). SRM techniques have a broad spectrum of applications in the field of biology and biophysics, allowing access to structural and dynamical information of known and unknown biological structures in vivo and in vitro. Many efforts have been made over the last decade to increase the potential of these methods by developing more precise and faster localization techniques, to improve fluorophore photophysics, to develop algorithms to obtain quantitative information and increase localization precision, etc. However, very few methods have been developed to dissect image heterogeneity and to extract statistically relevant information from thousands of individual super-resolved images. In my thesis, I specifically tackled these limitations by: (1) constructing objects with nanometer dimensions and well-defined structures with the possibility of be tailored to any need. These objects are based on DNA origami. (2) developing labeling approaches to homogeneously image these objects. These approaches are based on adaptations of BALM and DNA-PAINT microscopies. (3) implemented statistical tools to improve image analysis and validation. These tools are based on single-particle reconstruction methods commonly applied to image reconstruction in electron microscopy.I specifically applied these developments to reconstruct the 3D shape of two model DNA origami (in one and three dimensions). I show how this method permits the dissection of sample heterogeneity, and the combination of similar images in order to improve the signal-to-noise ratio. The combination of different average classes permitted the reconstruction of the three dimensional shape of DNA origami. Notably, because this method uses the 2D projections of different views of the same structure, it permits the recovery of isotropic resolutions in three dimensions. Specific functions were adapted from previous methodologies to quantify the reliability of the reconstructions and their resolution.In future, these developments will be helpful for the 3D reconstruction of any biological object that can be imaged at super resolution by PALM, STORM or PAINT-derived methodologies.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2015MONT3511 |
| Date | 27 November 2015 |
| Creators | Salas, Desireé |
| Contributors | Montpellier, Nollmann, Marcelo |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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