Η ολοκληρωμένη εκτίμηση της θειολικής οξειδοαναγωγικής κατάστασης (ΘΟΚ) ενός οργανισμού ιστού ή κυττάρου είναι πολύ σημαντική καθώς οξειδοαναγωγικές αλλαγές των διαφόρων θειολικών μορίων συνδέονται με το οξειδωτικό στρες και με αρκετές ασθένειες. Η γενική ΘΟΚ (ΓΘΟΚ) χαρακτηρίζεται από τις συγκεντρώσεις ορισμένων συνόλων θειολικών μορίων στην αναγμένη και την οξειδωμένη μορφή τους (θειολικά οξειδοαναγωγικά ζεύγη). Αυτά τα ζεύγη μπορεί να είναι μη πρωτεϊνικά (non-protein ή NP) (όπως NPSH και NPSSNP με το NP να συμβολίζει οποιαδήποτε άλλη μη πρωτεϊνική θειόλη) ή πρωτεϊνικά (protein ή P) (όπως PSH, PSSP και PSSNP). Ειδικότερα, οι κυριότερες μη πρωτεϊνικές θειόλες γλουταθειόνη (GSH) και κυστεΐνη (CSH) μαζί με τα συμμετρικά, μεικτά δισουλφίδιά τους και τις οξειδωμένες τους μορφές (GSSG, PSSG, PSSC, NPGSHox, NPCSHox,) είναι τα οξειδοαναγωγικά ζεύγη τα οποία χαρακτηρίζουν την ειδική ΘΟΚ (ΕΘΟΚ), καθώς είναι εκείνα που απαντώνται σε υψηλότερη συγκέντρωση στους οργανισμούς. Στη διεθνή βιβλιογραφία δεν υπάρχει μεθοδολογία για την ταυτόχρονη ποσοτικοποίηση των θειολικών μορίων που χαρακτηρίζουν τη ΘΟΚ των οργανισμών. Συνεπώς, στόχος της παρούσας μελέτης είναι η ανάπτυξη μιας νέας μεθόδου ποσοτικοποίησης τόσο της ΓΘΟΚ όσο και της ΕΘΟΚ, που να είναι εφαρμόσιμη σε όλους τους οργανισμούς. Για το διαχωρισμό πρωτεϊνικών και μη πρωτεϊνικών μορίων χρησιμοποιήθηκε το τριχλωροακετικό οξύ που σε ορισμένη συγκέντρωση (>5%) καταβυθίζει αποτελεσματικά όλες τις πρωτεΐνες. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των δισουλφιδικών μορίων και οξειδωμένων μορφών (NPSSNP, PSSP, PSSNP, GSSG, NPGSHox, NPCSHox, PSSG και PSSC) πραγματοποιήθηκε μετά από αναγωγή τους (με το αντιδραστήριο tributyl phosphine), ενώ ο ποσοτικός προσδιορισμός των ελεύθερων θειολών (PSH, NPSH, GSH και CSH) πραγματοποιήθηκε χωρίς την αναγωγή τους. Ειδικότερα, η ποσοτικοποίηση των αναγμένων διθειολικών ομάδων (δισουλφιδίων) και των ελεύθερων θειολών έγιναν με τα αντιδραστήρια 4,4-dithiodipyridine (για τις -SH ομάδες των αναγμένων δισουλφιδίων, καθώς και για τις ελεύθερες NPSH και PSH), o-phthalaldehyde (για την GSH, GSSG και NPGSHox) και νινυδρίνη (για την CSH και την NPCSHox), σε συνδυασμό με κατάλληλη μαθηματική επεξεργασία βασισμένη στη στοιχειομετρία των αντιδράσεων αναγωγής. Η υψηλή ευαισθησία της μεθόδου (στο επίπεδο του nmol) την καθιστά εφαρμόσιμη ακόμη και σε βιολογικά δείγματα χαμηλής περιεκτικότητας σε θειόλες (όπως πχ. το οφθαλμικό και το εγκεφαλονωτιαίο υγρό). / The thiol redox state (TRS) is an essential condition of prokaryotic and eukaryotic cells associated with all major biological processes. The general TRS (GTRS) part of it, is characterized by the levels of all thiol compounds of protein or non-protein origin in their reduced or oxidized form (thiol redox couples), while the specific TRS (STRS) by the levels of certain thiols, reduced and oxidized, free or membrane bound. The GTRS redox couples are composed of non-protein (NP) (such as NPSH and NPSSNP) or protein (P) (such as PSH, PSSP and PSSNP) thiols. On the other hand, the STRS redox couples are composed of the main non-protein thiol glutathione (GSH) and cysteine (CSH) together with their symmetric, mixed disulfides and oxidized forms (GSSG, PSSG, PSSC, NPGSHox, NPCSHox). In light of the fact that there is not available any appropriate method in literature for the simultaneous determination of the main thiol components that characterize TRS, a new method is developed for the purpose of this study for the quantification of GTRS and STRS, applicable to any organism. For the separation of protein from non protein thiols, trichloroacetic acid was chosen (at 5%) as the most effective protein precipitant. The determination of disulfides and oxidized forms (NPSSNP, PSSP, PSSNP, GSSG, PSSG, PSSC, NPGSHox and NPCSHox) was accomplished after their reduction with the tributyl phosphine (which, because of its hydrophobicity effectively reduces protein thiols as well), whereas the quantification of free thiols (PSH, NPSH, GSH and CSH) was accomplished without reduction. Reduced disulfides and free thiols were quantified by the more effective than DTNB 4,4-dithiodipyridine (for the determination of -SH groups of reduced disulfides as well as of free NPSH and PSH), o-phthalaldehyde (for the specific determination of GSH, GSSG and NPGSHox) and ninhydrin (for the specific determination of CSH and NPCSHox). The high sensitivity of the method (in the level of nmoles) makes it applicable even in biological samples of very low thiol concentration (such as ophthalmic or cerebrospinal fluid).
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/3794 |
| Date | 28 September 2010 |
| Creators | Σταματίου, Ειρήνη |
| Contributors | Γεωργίου, Χρήστος, Stamatiou, Irene, Παναγόπουλος, Νικόλαος, Κεφαλιακού, Μαρίνα, Γεωργίου, Χρήστος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 6 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.003 seconds