Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen dienten dazu, die Eigenschaften und Grundlagen zur Regulation der chloroplastidären NAD(P)(H)-GAPDH im Wechsel zwischen Licht- und Dunkelmetabolismus aufzuklären. Dazu wurden Untersuchungen mit dem System ‘isoliertes Enzym’ und dem System ‘isolierte Chloroplasten’ durchgeführt. Durch die Herstellung proteolysierter NAD(P)(H)-GAPDH und rekombinanter Untereinheiten GapAM, GapBM und GapBMDC, sowie gleichzeitig exprimierter GapAMBM und GapAMBMDC war die Möglichkeit geschaffen, die Funktion der CTE bei der Regulation zu untersuchen. Eigenschaften von NAD(H)-abhängiger plastidärer GapCp konnten mit angereinigtem und rekombinant hergestelltem Enzym aus roter Paprikafrucht ermittelt werden.
Regulation von NAD(P)(H)-GAPDH im isolierten intakten Chloroplasten aus Spinat
Durch Reduktion von NAD(P)(H)-GAPDH in belichteten isolierten intakten Spinatplastiden, vermutlich durch Thioredoxinf, ist das Enzym sensitiver gegenüber 1,3bisPGA, da der Ka-Wert von 17-21 µM auf ca. 1-2 µM gesenkt wird. Die gleichzeitig steigende Konzentration von 1,3bisPGA auf ca. 0,8 µM im Chloroplasten führt zur Aktivierung und damit verbundener Dissoziation des Enzyms. Die Aktivierung betrifft ausschließlich die NADPH-abhängigen Aktivitäten. NADPH, NADP und ATP scheiden als Aktivatoren in vivo aus, da sie bei im Chloroplasten im Licht und im Dunkeln herrschenden Konzentrationen von 140 µM NAD das Enzym nicht aktivieren und unphysiologisch hohe Konzentrationen der Effektoren zur Aktivierung des Enzyms benötigt würden. Die Inaktivierung im Dunkeln erfolgt durch Absenkung der 1,3bisPGA-Konzentration, und das Enzym wird durch ein bislang nicht bekanntes Oxidationsmittel oxidiert. NAD, sowie möglicherweise auch GAP und NADH sind an der Inaktivierung und gleichzeitigen Aggregation beteiligt.
Die CTE der Untereinheit B ist für die Aggregation/Dissoziation von NAD(P)(H)-GAPDH verantwortlich
Im Vergleich von NAD(P)(H)-GAPDH-Isoenzymen besitzt ausschließlich GapB aus Chloroplasten höherer Pflanzen eine CTE von 28-32 Aminosäuren Länge. Sie ist gekennzeichnet durch zwei konservierte Cysteine, zwischen denen sich acht Aminosäuren befinden. In der Mitte dieser acht Aminosäuren befindet sich ein Prolin, welches u.a. für den Richtungswechsel bei der Faltung eines Proteins verantwortlich ist, so dass sich zwischen den beiden Cysteinen eine Disulfidbrücke ausbilden könnte. Die CTE aus Spinat besitzt außerdem einen hohen Anteil von sieben negativ geladenen Aminosäuren. In Rahmen dieser Arbeit wurde ein Modell enwickelt, welches beinhaltet, dass die Aggregation von vier (A2B2)-Tetrameren über Salzbrückenbindung negativ geladener Aminosäuren der CTE und nach außen exponierten positiv geladenen Aminosäuren von GapA vermittelt wird. Ergebnisse mit NAD(P)(H)-GAPDH, der die CTE fehlt, d.h. proteolysierte NAD(P)(H)-GAPDH und rekombinant hergestellte GapAM, GapBMDC und GapAMBMDC bestätigen das Modell. Die drei tetrameren Formen, sowie die gleichzeitig exprimierte GapAMBMDC sind nicht fähig, zu aggregieren. Ausschließlich GapB und die gleichzeitig exprimierte GapAMBMC aggregieren in eine hochmolekulare Form von ca. 470 kDa, bzw. eine Mischung von 470 und 300 kDa.
Die CTE der Untereinheit B ist für die Redoxmodulation von NAD(P)(H)-GAPDH verantwortlich.
NAD(P)(H)-GAPDH höherer Pflanzen besitzt fünf konservierte Cysteine: 18, 149, 153, 274 und 285, wovon sich Cystein 149 und Cystein 153 im aktiven Zentrum befinden. Cystein 153 in nicht an der Katalyse beteiligt. In der CTE von GapB sind zusätzlich zwei Cysteine 355 und 364 konserviert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die lange Zeit
prognostizierte intramolekulare Disulfidbrücke zwischen Cystein 18 und 285 nicht vorhanden ist. Dies ergibt sich aus der Tatsache, dass in Algen, deren NAD(P)(H)-GAPDH als redoxmoduliert beschrieben ist, Cystein 285 nicht vorkommt. Weiterhin zeigen eigene Ergebnisse, dass NAD(P)(H)-GAPDH, der die CTE fehlt, d.h. proteolysierte NAD(P)(H)-GAPDH, rekombinant hergestellte GapAM und GapBMDC, weder durch DTTred noch in Kombination mit 1,3bisPGA aktiviert werden. Die tetrameren Formen sind nicht redoxmoduliert. Daraus wird gefolgert, dass die für die Redoxmodulation verantwortliche Disulfidbrücke sich in der CTE von GapB befindet.
Die CTE der Untereinheit B ist für die Nucleotidspezifität von NAD(P)(H)-GAPDH verantwortlich
Die Bindung von NADPH, bzw. NADH in den verschiedenen Isoenzymen von NAD(P)(H)-GAPDH hängt von der Aminosäurezusammensetzung in den Positionen 32, 33, 187 und 188 ab. Die Aminosäuren 187 und 188 befinden sich auf einem S-loop, der in das aktive Zentrum eines benachbarten Monomers hineinreicht und mit ihm eine funktionelle Einheit bildet. NAD(H) wird in den Positionen 32 und 33 gebunden; eine Bindung von NADP(H) ist durch sterische Hinderung und Ladung des Prolins 188, welches in cytosolischer NAD(H)-GAPDH vorkommt, nicht möglich. Da chloroplastidäre NAD(P)(H)-GAPDH in der Position 188 ein Serin besitzt, kann die Phosphatgruppe von NADP(H) binden. Aufgrund der Affinitäten der inaktiven 600 kDa- und aktiven 150 kDa-NAD(P)(H)-GAPDH für NADPH, bzw. der in Chloroplasten im Licht wie im Dunkeln herrschenden NADPH-Konzentrationen, wäre es theoretisch möglich, dass das Coenzym sowohl bei Belichtung als auch im Dunkeln umgesetzt wird. Während des Licht-Dunkel-Übergangs wechselt das Enzym jedoch zwischen dem Coenzym NADPH und NAD. In dieser Arbeit konnte anhand eines Modells aufgezeigt werden, dass im Dunkel-adaptierten Chloroplasten die Bindung von NADPH an der Aminosäure 188 unterbunden ist, da der S-loop um einige A aus dem aktiven Zentrum gezogen wird. Ursache dafür ist mit großer Wahrscheinlichkeit die CTE, die in der 600 kDa-Form an positiv geladenen Aminosäuren des S-loops bindet.
Die Aktivierung von NAD(P)(H)-GAPDH in struktureller Hinsicht.
Die 600 kDa-Form von NAD(P)(H)-GAPDH ist mit dem Coenzym NADPH inaktiv, da sich innerhalb der CTE eine Disulfidbrücke gebildet hat. Die strukturelle Änderung der CTE erlaubt es, dass negativ geladenene Aminosäuren der CTE an nach außen exponierten positiv geladenen Aminosäuren eines S-loops von GapA binden können. Dadurch ist eine Bindung von NADPH im aktiven Zentrum an den S-loop nicht möglich. NAD kann ungehindert binden. Bei einsetzender Belichtung wird die Disulfidbrücke der CTE aufgebrochen, ohne dass das Enzym dissoziert. Mit steigenden Konzentrationen von dreifach negativ geladenem 1,3bisPGA wird die Salzbrückenbindung zwischen der CTE und dem S-loop gelöst, so dass NAD(P)(H)-GAPDH in vier Tetramere dissoziiert und gleichzeitig NADPH umsetzen kann.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-osnabrueck.de/oai:repositorium.ub.uni-osnabrueck.de:urn:nbn:de:gbv:700-2004070814 |
| Date | 08 July 2004 |
| Creators | Baalmann, Elisabeth |
| Contributors | Prof. Dr. Renate Scheibe, apl. Prof. Dr. H. Scholze |
| Source Sets | Universität Osnabrück |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/zip, application/pdf |
| Rights | http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/ |
Page generated in 0.0028 seconds