Daugelio T-lyginių ir kai kurių kitų T4 tipo bakteriofagų genomuose yra koduojama unikali endoribonukleazė RegB, kol kas neturinti homologijos su jokiais žinomais baltymais ar kitomis nukleazėmis. Tai yra sekai specifinė endoribonukleazė, kuri atpažįsta mRNR GGAG (rečiau GGAU) sekos motyvą ir hidrolizuoja jį per patį sekos vidurį. Geriausiai ištirta yra fago T4 endoribonukleazė RegB, tuo tarpu kitų T4 tipo fagų koduojamos RegB, ypač tos, kurios turi žymiai pakitusią pirminę struktūrą, kol kas yra tik pradinių tyrimų stadijoje. Šiame darbe buvo sukonstruoti 4 bakteriofagų RB69 ir RB49 temperatūrai jautrūs mutantai: MRB69RegB_M11, RB69RegB_M41, RB49_M97 ir RB49RegB_ts2. Šių RegB mutantų aktyvumo tyrimai buvo atliekami nustatant regB mRNR nukleotidų seką žymėto pradmens ilginimo metodu. Buvo nustatyta, kad RegB aktyvumas prie 30ºC buvo žymiai ryškesnis nei prie 42ºC temperatūros trijų mutantinių RegB atveju (M11, M41 ir ts2). Taip pat buvo pastebėta, jog šie mutantiniai RegB variantai yra mažiau toksiški Escherichia coli ląstelėms prie 42ºC nei prie 30ºC. regB_ts2 genas koduoja ryškiausiu temperatūriniu jautrumu pasižymintį baltymą, todėl jis buvo panaudotas tolimesniems tyrimams. Minėtasis genas buvo klonuotas į vektorių pLT532, kuriame yra lacZ genas sulietas su RegB taikiniu (GGAG seka). Buvo nustatyta, kad RegB_ts2 skelia lacZ transkriptus indukuotus nuo plazmidės ir taip gali reguliuoti jo transliaciją. / The regB gene of T4 – related bacteriophages codes for an endoribonuclease that controls the expression of a number of phage early genes. The RegB protein cleaves its mRNA substrates with an almost absolute specificity in the middle of the tertranucleotide GGAG or, in a few cases, GGAU tetranucleotide making it a unique site-specific restriction endoribonuclease. Endoribonuclease RegB of phage T4 have been studied for almost 20 years, while the homologues of RegB from phylogeneticaly distant T4-type phages deserved only initial studies. In this study, four temperature sensitive mutants of bacteriophages RB49 and RB69 endoribonuclease RegB have been constructed. The activities of RegB mutants RB69RegB_M11, RB69RegB_M41 and RB49RegB_ts2, as determined by primer extension analysis of regB transcripts, were detectable at 30ºC and decreased markedly at 42ºC temperature. We found that these mutants were less toxic to Escherichia coli cells at 42ºC than at 30ºC. The regB_ts2 gene, coding for the most clear RegB temperature sensitive mutant, was cloned into the vector pLT532, which carries lacZ gene fused with the Shine-Dalgarno region of T4 gene 30.7 carrying RegB cleavage site. We found that RegB_ts2 cleaves the lacZ transcripts induced from this plasmid and regulates its translation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LABT_ETD/oai:elaba.lt:LT-eLABa-0001:E.02~2007~D_20101125_183215-95771 |
| Date | 25 November 2010 |
| Creators | Strazdaitė, Živilė |
| Contributors | Nivinskas, Rimantas Steponas, Vilnius University |
| Publisher | Lithuanian Academic Libraries Network (LABT), Vilnius University |
| Source Sets | Lithuanian ETD submission system |
| Language | Lithuanian |
| Detected Language | English |
| Type | Master thesis |
| Format | application/pdf |
| Source | http://vddb.laba.lt/obj/LT-eLABa-0001:E.02~2007~D_20101125_183215-95771 |
| Rights | Unrestricted |
Page generated in 0.0023 seconds