Os genes de choque térmico groES e groEL de Caulobacter crescentus foram isolados utilizando-se os genes homólogos de E.coli como sonda e por sequenciamento demonstrou-se que estes genes estão organizados na forma de um operon em um fragmento de DNA de aproximadamente 2,5 kb, contendo também sua região regulatória. \"Northern blots\" de RNA total de células crescidas a 300C ou submetidas a choque térmico mostraram a presença de um único RNA de tamanho aproximado de 2,3kb, altamente induzido por choque térmico, permanecendo em altos níveis mesmo após longos períodos de choque térmico. Amostras de RNA total de células sincronizadas, de diferentes estágios do ciclo celular de Caulobacter, foram também analisadas mostrando que os níveis do mRNA groESL variam durante o ciclo, apresentando um máximo na célula prédivisional. Análises através de \"Western blot\" mostraram uma pequena variação nos níveis da proteína GroEL ao longo do ciclo celular, sendo os tempos 60 e 120 minutos, respectivamente, os pontos de mínimo e máximo acúmulo da proteína concordando com os resultados obtidos em \"N orthern blots\". O mesmo tipo de análise foi feito com extratos totais obtidos a partir uma população mista de células crescidas a 300C e submetidas a choque térmico, observando-se o acúmulo da proteína até 60 minutos depois do choque térmico, com aumento da ordem de 5 vezes nos níveis de GroEL, níveis estes que diminuem lentamente a partir deste ponto. Os inícios de transcrição foram determinados em experimentos de \"primer extension\" utilizando-se RNA total de células incubadas 300C e de células submetidas a diferentes condições de choque térmico. Dois possíveis sítios de início de transcrição foram determinados nas posições -119 e -88 do ATG da metionina iniciadora de groES, sendo as regiões -10 e -35 dos promotores correspondentes (P 1 e P2) identificadas. Somente a transcrição iniciando a partir de P2, que apresenta características de um promotor transcrito pelo σ32, aumenta durante o choque térmico. Fusões de transcrição com o vetor repórte placZ/290 e a região 5\' regulatória do operon groESL foram construídas para identificar as sequências responsáveis pelo controle por choque térmico e pelo controle temporal. Fusões de transcrição contendo deleções na região 5\' do operon mostraram que sequências a montante do promotor P2 não são necessárias para a indução por choque térmico ou para o controle temporal. Fusões de transcrição contendo mutações sítio-dirigidas na repetição invertida, encontrada a 3\' do promotor P2, antes do gene groES, revelaram que este elemento, conhecido como CIRCE, regula negativamente a expressão de groESL a 300C e mutações neste elemento levam à perda do controle temporal deste operon. / The heat shock genes groES and groEL of Caulobacter crescentus were isolated using the homologous genes of E.colí as a probe. DNA sequence analysis has shown that these genes are organized as an operan in a fragment of about 2.5kb, which includes the 5\' regulatory region. Northern blot analysis of total RNA from cells grown at 300C or heat shocked treated has shown the presence of a single mRNA species for groESL, of approximately 2.3kb in size, which presented increased leveis even after long periods of heat shock. Samples of total RNA from synchronized cells, corresponding to different stages of the Caulobaaer cell cycle, were also analysed, showing that the amount of groESL mRNA varies during the cycle, with maximum leveis in predivisional cells. Western blot analysis of GroEL leveis in Caulobaaer has shown that the amount of the protein decreases during the first 60 minutes of C.crescentus cell cycle and then starts to increase again. These results corroborate the data obtained with Northern blot analysis. A similar experiment was performed after exposing a mixed population of C.crescentus cells to different times of heat shock at 400C. Western blot of extracts of these cells showed a fivefold increase in the leveis of GroEL after 60 minutes of heat shock, which then begins to decrease. Primer extension experiments were performed using total RNA from cells incubated at normal growth temperature or after heat shock treatment. Two possible transcription start sites were determined at positions -119 and -88 from the ATG of the groES initiator methionine and the -10 and -35 regions of the corresponding promoters (P 1 and P2) were identified. Only trancription initiating from the P2 promoter, which has caracteristics of a σ32 promoter, I ncreases during heat shock .Transcription fusions with the reporter vector placZ/290 and the 5\' regulatory region of the groESL operan were contructed in order to identify the sequences responsible for heat shock and cell cycle contral. Deletion analysis in the 5\' region of the operon showed that no sequences upstream of the P2 promoter are necessary for heat shock induction or for temporal contral. Site-directed mutagenesis in the inverted repeat found 3\' of the P2 promoter, in front of the groES gene, revealed that this element, also known as CIRCE, negatively regulates groESL expression at 300C and mutations in it lead to loss of temporal control of this heat shock operon.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-03022014-162407 |
| Date | 24 May 1996 |
| Creators | Avedissian, Marcelo |
| Contributors | Gomes, Suely Lopes |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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