Entre as modificações sofridas pelo transcrito primário de RNA de eucariontes, o splicing é responsável pela colocação lado a lado das sequências expressas alinhando a região codificadora no RNAm. Este mecanismo, descrito na década de 1970, como o responsável pela remoção dos íntrons e junção dos éxons consecutivos, é efetuado por um complexo ribonucleoprotéico conhecido como spliceossomo. O reconhecimento por este complexo dos segmentos definidos como éxons e íntrons depende de diversas sequências presentes no RNA e reconhecidas por ligantes protéicos. A modulação desta interação resulta na geração de diferentes transcritos maduros a partir de um mesmo gene, evento conhecido como splicing alternativo, comum a maioria dos genes humanos e um dos grandes responsáveis pela geração de variabilidade proteômica dos eucariotos e sua complexidade morfo-fisiológica. O splicing alternativo é um importante gerador de diversidade funcional no sistema nervoso central, onde participa da geração de variantes para mais de 80% dos genes. Entre estes está o gene do Retardo Mental do X Frágil (FMR1), cujo transcrito primário pode sofrer splicing alternativo de quatro éxons, produzindo até vinte isoformas diferentes da FMRP. Os objetivos gerais deste projeto foram (i) a análise da expressão do éxon 12 do Fmr1 em córtex cerebral frontal, hipocampo e cerebelo de ratos em E19 e P2; e (ii) a busca por elementos em cis reguladores do splicing do éxon 12 do Fmr1 de rato. Para averiguar os níveis da expressão do éxon 12 do Fmr1, no final do período embrionário e início do pós-natal de rato, foi realizada RT-PCR em tempo real com os tecidos citados acima, em E19 e P2. Observamos significativa inclusão do éxon 12 nos transcritos do Fmr1 no córtex frontal em P2 quando comparado a E19, o que não se relacionou ao aumento geral da expressão do Fmr1. No hipocampo, houve aumento da expressão do conjunto de mensagens do Fmr1 e tendência à exclusão do éxon 12 em P2, quando comparado a E19. Estes dados revelam o córtex cerebral como fonte de proteínas ativadoras do splicing do éxon 12 do Fmr1 e onde se deve buscar pela relevância funcional das isoformas da FMRP expressando este éxon. A busca por elementos reguladores do splicing do éxon 12 se baseiou na avaliação da expressão por RT-PCR de mini-gene de segmento genômico do gene Fmr1 usado para transfectar células C6 (glioma de rato). Estas células demonstraram inclusão preferencial do éxon 12 em seus transcritos superexpressos. Um segundo clone foi gerado com uma deleção a partir do clone original, na região 5 do íntron 12, na qual observamos in silico, elementos ricos em U e C, candidatos a acentuadores da inclusão do éxon 12. A superexpressão deste clone em C6 revelou exclusão preferencial do éxon 12, um padrão invertido em relação ao anteriormente observado. Estes dados indicam o elemento rico em U e C como um forte candidato a acentuar a inclusão do éxon 12 no RNAm do Fmr1. / Splicing is an important hnRNA processing mechanism in eukaryotes, aligning exons in the mRNA. First described in the 1970s, it is performed by a molecular complex named spliceosome, which recognizes RNA sequences in the boundaries between exons and introns. Interaction modulation in the spliceosome results in mature transcripts with varying sizes, a process known as alternative splicing, common to most human genes and the major mechanism leading to proteomic diversity and morphological and functional complexity in eukaryotes. Alternative splicing is very important in generating functional diversity in the central nervous system (CNS), where it takes part in more than 80% of primary transcript processing. Among these is the Fragile Mental Retardation 1 gene (FMR1), which undergoes alternative splicing of four exons creating the possibility of 20 non-redundant FMRP isoforms. The aims of this project were (i) to analyze the expression of rat Fmr1 exon 12 in frontal cerebral cortex, hippocampus, and cerebellum at E19 and P2 days; and (ii) to search for cis-acting elements regulating exon 12 splicing. We performed real-time RT-PCR to examine Fmr1 exon 12 expression, in the above-mentioned CNS structures, between the end of embryonic period and the second postnatal day. We observed significant inclusion of exon 12 in Fmr1 mRNA in frontal cortex at P2 as compared to E19, which was unrelated to general Fmr1 expression increase. At P2 hippocampus there was a significant increase at the expression levels of Fmr1, and a trend to exclude exon 12 from the primary transcript. This data indicates that cerebral cortex is an important source of proteins activating exon 12 splicing, and also a tissue where the functional relevance of FMRP isoforms expressing exon 12 should be regarded. We adopted the mini-gene approach to search for cis elements regulating Fmr1 exon 12 splicing. RTPCR was performed to evaluate C6 (rat glioma) cells overexpressing a clone containing a genomic Fmr1 segment. Transfected cells revealed preferential inclusion of Fmr1 exon 12. A deletion construct lacking the initial bases of intron 12 was generated. The deleted segment harbor U- and C-rich sequences that had been identified in silico in a search for intronic splicing enhancers. Overexpression of the deletion construct in C6 yielded to preferential exclusion of exon 12, as opposed to the expression pattern previously observed in the original clone. Therefore, the U- and C-rich elements at Fmr1 intron 12 are strong candidates to enhance Fmr1 exon 12 splicing.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-19032009-144613 |
| Date | 17 December 2008 |
| Creators | Velloso, Fernando Janczur |
| Contributors | Haddad, Luciana Amaral |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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